ПТР реагенттеринин алгачкы стадиясында праймерлердин жана зонддордун иштешин текшерүү жана эң ылайыктуу реакция шарттарын аныктоо формалдуу эксперименттердин үзгүлтүксүз жүрүшүн камсыз кылуу үчүн зарыл шарттар болуп саналат.
Ошентип, биз алгачкы этапта праймердик иликтөөнү кантип ырасташыбыз керек?
Негизги көрсөткүчтөр – базалык сызык, күчөтүү ийри сызыгы, КТ мааниси, күчөтүү эффективдүүлүгү, аз концентрациялуу үлгүлөрдү аныктоо, CV ж.б.
Базалык
Базалык сызык - бул ПТР күчөтүү ийри сызыгындагы горизонталдык сызык.ПЦР күчөтүү реакциясынын алгачкы бир нече циклдеринде флуоресценция сигналы көп деле өзгөрбөйт жана түз сызыкты түзөт.Бул түз сызык негизги болуп саналат.
ПТР праймер зонддорун скринингде, базалык деңгээлдин деңгээлине көңүл буруңуз.Праймер зондунун концентрациясынын тазалыгы базалык сызыкка таасирин тийгизет, мисалы, базалык сызыктын көтөрүлүшүнө же төмөндөшүнө алып келет.Базалык көрсөткүч да абдан интуитивдик көрсөткүч болуп саналат.
Күчөтүү ийри сызыгы
Дагы бир интуитивдик көрсөткүч - бул күчөтүү ийри сызыгынын формасы.Экинчилик күчөтүүнүн же башка анормалдуу күчөтүү ийри сызыгын болтурбоо үчүн S түрүндөгү ийри сызыктын болушу эң жакшы.
Ct Value
Базалык сызыктан экспоненциалдык өсүшкө чейинки ийилүү чекитине туура келген циклдердин саны Ct мааниси болуп саналат.
Бир эле үлгү үчүн ар кандай праймердик зонддор ар кандай күчөтүү ийри сызыктарын пайда кылат жана тиешелүү Ct маанисине күчөтүү эффективдүүлүгү жана интерференция даражасы таасир этет.Теориялык жактан алганда, биз тандаган праймер зондунун Ct мааниси канчалык аз болсо, ошончолук жакшы.
Күчөтүү натыйжалуулугу
ПЦР күчөтүү эффективдүүлүгүн баалоо үчүн эң ишенимдүү жана туруктуу методдордун бири стандарттык ийри сызык болуп саналат, ал дагы изилдөөчүлөр тарабынан кеңири таанылган.Метод максаттуу калыптардын салыштырмалуу санын көзөмөлдөө үчүн бир катар үлгүлөрдү жасоону камтыйт.Бул үлгүлөр, адатта, концентраттык эритмелердин сериялык эритмелери менен даярдалат, эң көп колдонулганы 10 эселенген суюлтуу.Суюлтулган үлгүлөрдүн сериясын колдонуп, стандарттык qPCR программасын колдонуп, күчөтүү Cq маанисин алуу жана акырында Cq= -klgX0+b сызыктуу теңдемесин жана E=10(-1 /k)-1 күчөтүү эффективдүүлүгүн алуу үчүн ар бир үлгүнүн концентрациясына жана тиешелүү Cq маанисине ылайык стандарттык ийри сызык түзүңүз.Сандык талдоо үчүн qPCR колдонууда күчөтүү эффективдүүлүгү 90%-110% (3,6>k>3,1) диапазонунда болушу талап кылынат.
Төмөн концентрациядагы үлгүлөрдү аныктоо
Үлгү концентрациясы төмөн болгондо, ар кандай праймердик зонддордун аныктоо ылдамдыгы ар кандай болот.Биз репликациялоо үчүн концентрациясы аз 20 үлгүнү тандайбыз жана эң жогорку аныктоо ылдамдыгы менен праймер-зонд системасы эң жакшы.
Вариация коэффициенти (CV)
Нуклеиндик кислотанын күчөшүн аныктоочу реагенттин линия стандартына ылайык 10 кайталанган үлгүлөрдү ар кандай праймердик зонддор менен аныктоого болот.
Сандык реагенттер:
Тактык
Бир партиядагы тактык төмөнкүлөргө жооп бериши керек: сыноо концентрациясынын логарифмдик маанисинин вариация коэффициенти (CV,%) ≤5%.Үлгү концентрациясы төмөн болгондо, аныктоо концентрациясынын логарифминин вариация коэффициенти (CV,%) ≤10%
Сапаттуу реагенттер:
Тактык
Бир партиядагы тактык төмөнкүлөргө жооп бериши керек:
(1) Ct маанисинин өзгөрүү коэффициенти (CV,%) ≤5%
Ошол эле үлгү 10 жолу параллелдүү сыналат жана тесттин натыйжалары ырааттуу болушу керек
Посттун убактысы: 2021-жылдын 18-сентябрына чейин
