Түз ПТР – бул нуклеин кислотасын экстракциялоосуз күчөтүү үчүн жаныбарлардын же өсүмдүктөрдүн ткандарын түздөн-түз колдонгон реакция.Көп жагынан алганда, түздөн-түз ПТР кадимки ПТР сыяктуу иштейт

Негизги айырмачылык - бул түз ПТРде колдонулуучу атайын буфер, үлгү нуклеин кислотасын экстракциялоосуз эле ПТР реакциясына түздөн-түз дуушар болушу мүмкүн, бирок ферменттердин толеранттуулугуна жана тике ПТР реакциясына катышкан буфердин шайкештигине тиешелүү талаптар бар.

Жалпы үлгүлөрүндө аздыр-көптүр ПТР ингибиторлору бар болсо да, түз ПТР дагы эле ферменттердин жана буферлердин иш-аракети астында ишенимдүү күчөтүүгө жетише алат.Салттуу ПТР реакциясы шаблон катары жогорку сапаттагы нуклеин кислотасын талап кылат, ал эгер калыпта белоктор жана башка аралашмалар бар болсо, ПТР реакциясынын бир калыпта жүрүшүнө тоскоол болот.Түз ПТР учурда молекулярдык диагностика тармагындагы эң популярдуу технологиялардын бири болуп саналат.

01 Түз ПТР алгач жаныбарлар жана өсүмдүктөр үчүн колдонулган

Түз ПТРдин эң алгачкы колдонулушу жаныбарлардын жана өсүмдүктөрдүн, мисалы, келемиштин, мышыктын, тооктун, коёндун, койдун, бодо малдын каны, кыртышы жана жүндөрү ж.б., өсүмдүк жалбырактары жана уруктары ж.б., генотипти изилдөө үчүн колдонулат, трансгендик, плазмидди аныктоо, ген нокаут анализи, ДНК булагын аныктоо, түрлөрдү аныктоо, SNP жана башка тармактарда.

Бул талаалар кээ бир жалпы өзгөчөлүктөрү бар, башкача айтканда, максаттуу ген мазмуну салыштырмалуу жогору жана нуклеин кислотасын экстракция түйшүктүү болуп саналат, ошондуктан түздөн-түз ПТР убакытты үнөмдөө жана натыйжаларга бир аз таасир гана эмес, ошондой эле чыгымдарды үнөмдөй алат.

Патогенди аныктоо үчүн колдонулган түз ПТР акыркы жылдардагы маселе, кээ бир ПТР реагенттерин өндүрүүчүлөр инновацияларды жасоодо бул багытта көп аракеттерди жасашты.Өзгөчө бул COVID-19 эпидемиясында, рынокто көптөгөн аныктоочу продуктулар пайда болду, мисалы, SARS-CoV-2 Нуклеиндик кислотаны аныктоочу комплект (Мультиплекстүү ПТР Флуоресценттик зонд методу) Foregene тарабынан изилденген жана иштелип чыккан, ал реалдуу убакыт режиминде RT PCR технологиясын (rRT-PCR) адамдын нуклеиндик-намырдын нуклеотирин сапаттык аныктоо үчүн колдонот. гарингеалдык тампон үлгүлөрү.

Foregene кадимки ORF1ab, N, E жана аныктоо үчүн Түз ПТР технологиясын колдонгон компаниялардын бири болуп саналат.вариант SARS-CoV-2 B.1.1.7 lineage (UK), B.1.351 lineage (ZA), B.1.617 lineage (IND) жана P.1 lineage (BR) сыяктуу адамдын назофарингеалдык же орофарингеалдык тампон үлгүлөрүндөгү нуклеиндик кислоталардын линиялары.

02  Түздөн-түз ПТР үчүн керектүү реагенттер

Лизат үлгүсү

Лизат үлгүсүн өзүңүз конфигурациялоого же сатып алууга болот.Лизаттын ар кандай маркаларынын составындагы айырма лиздөө жөндөмдүүлүгүн башкача кылат, андан кийин лиздөө убактысы бир аз башкача болот.Мисалы, жаныбарлардын ткандарынын үлгүлөрүн даярдоо үчүн жалпысынан 30 мүнөт же түн ичинде лизис сунушталат, ал эми вирустар үчүн лизис эритмеси 3-10 мүнөткө чейин созулат.

PCR мастер аралашмасы

Өзгөчө күчөтүүнү күчөтүү жана күчөтүү жөндөмдүүлүгүн жогорулатуу үчүн ысык баштоо ДНК полимеразасын колдонуу сунушталат.Түз ПТРдин өзөгү өтө толеранттуу полимераза болуп саналат.

ДНКнын күчөшүнө таасир этүүчү үлгүдөгү компоненттерди жок кылуу же бөгөт коюу

Үлгү лизат, белоктор, липиддер жана башка клетка калдыктары менен иштетилгенден кийин, бул заттар ПЦР реакциясын токтотот.Ошондуктан, түздөн-түз ПТР бул факторлордун таасирин азайтуу үчүн тиешелүү алып салуу же ингибиторлорду кошууну талап кылат.

03  Түз ПТРдин беш билим пункттарынын жыйындысы

Биринчиден, Түз ПТР технологиясы ар кандай биологиялык үлгүлөр үчүн түз ПТР технологиясы болуп саналат.Бул техникалык шартта нуклеин кислотасын бөлүп алуунун жана экстракциялоонун, ткандардын үлгүсүн объект катары түздөн-түз колдонуунун жана ПТР реакциясын жүргүзүү үчүн максаттуу ген праймерлерин кошуунун кереги жок.

Экинчиден, Түз ПТР технологиясы салттуу ДНК үлгүсүн күчөтүү технологиясы гана эмес, ошондой эле РНК шаблонунун тескери транскрипциясынын ПТРди камтыйт.

Үчүнчүдөн, Түз ПТР технологиясы кыртыш үлгүлөрүндө кадимки сапаттык ПТР реакцияларын түздөн-түз аткарбастан, ошондой эле Реактивдүү qPCR реакцияларын камтыйт, бул реакция системасы күчтүү антифондук флуоресценциянын кийлигишүү жөндөмдүүлүгүнө ээ болушун жана эндогендик флуоресценциянын антагонисттик жөндөмүн өчүрүүнү талап кылат.

Төртүнчүдөн, Түз ПТР технологиясы менен багытталган үлгүлөр нуклеиндик кислотанын шаблондорун чыгарууну гана талап кылат жана ПТР реакциясына тоскоол болгон протеиндерди, полисахариддерди, туз иондорун ж.б. жок кылбайт.Бул реакция системасындагы нуклеин кислотасынын полимеразасы жана ПТР аралашмасы татаал шарттарда ферменттин активдүүлүгүн жана репликациянын тактыгын камсыз кылуу үчүн эң сонун каршылыкка жана ийкемдүүлүккө ээ болушун талап кылат.

Бешинчиден, нуклеиндик кислотаны байытуу процедурасы жок Түз ПТР технологиясы менен багытталган кыртыш үлгүсү жана шаблондун көлөмү өтө аз, бул реакция системасынын өтө жогорку сезгичтигин жана күчөтүү эффективдүүлүгүн талап кылат.