Флуоресценттик сандык ПТР (ошондой эле TaqMan ПТР, мындан ары FQ-PCR деп аталат) 1995-жылы Америка Кошмо Штаттарында PE (Перкин Элмер) тарабынан иштелип чыккан жаңы нуклеин кислотасынын сандык технологиясы. Бул технология флуоресценттик белгиленген зонддорду кошуу менен кадимки ПТРге негизделген.ийкемдүү ПТР менен салыштырганда, FQ-PCR анын сандык функциясын ишке ашыруу үчүн көптөгөн артыкчылыктарга ээ.Бул макалада технологиянын мүнөздөмөлөрү, принциптери, ыкмалары жана колдонулуштары кыскача сүрөттөлөт.
1 Өзгөчөлүктөрү
FQ-PCR кадимки ПТРдин жогорку сезгичтигине гана ээ болбостон, ошондой эле флуоресценттик зонддорду колдонуунун аркасында, ал кадимки ПТРдин көптөгөн кемчиликтерин жоюп, сандык натыйжаларды алуу үчүн фотоэлектрдик өткөргүч системасы аркылуу ПТР күчөтүү учурунда флуоресценттик сигналдын өзгөрүшүн түздөн-түз аныктай алат, ошондуктан ал ДНКнын жогорку спецификасына жана актропиялык жогорку технологияга ээ.
Мисалы, жалпы ПТР продуктуларын агароздук гел электрофорез жана этидий бромидинин ультрафиолет нурлары менен боёосу же полиакриламиддик гель электрофорези жана күмүшкө боёосу аркылуу байкоо керек.Бул бир нече инструменттерди гана талап кылбастан, ошондой эле убакытты жана күч-аракетти талап кылат.Этидий бромиди колдонулган тактар адамдын организмине зыяндуу жана бул татаал эксперименталдык процедуралар булганууга жана жалган позитивтерге мүмкүнчүлүк берет.Бирок, FQ-PCR үлгүсүн жүктөө учурунда капкакты бир жолу гана ачуу керек, андан кийинки процесс толугу менен жабык түтүкчө операциясы болуп саналат, ал ПЦРден кийинки иштетүүнү талап кылбайт, кадимки ПТР операцияларында көптөгөн кемчиликтерден качат.Эксперимент жалпысынан PE компаниясы тарабынан иштелип чыккан ABI7100 ПЦР жылуулук циклдерин колдонот.
Аспап төмөнкү мүнөздөмөлөргө ээ: ① Кеңири колдонуу: Аны ДНК жана РНК ПТР продуктуларын сандык аныктоо, ген экспрессиясын изилдөө, патогенди аныктоо жана ПТР шарттарын оптималдаштыруу үчүн колдонсо болот.② Уникалдуу сандык принцип: Флуоресценттик белгиленген зонддорду колдонуу менен флуоресценциянын көлөмү лазердик дүүлүктүрүүдөн кийин ПТР циклинде топтолуп, сандык аныктоо максатына жетет.③ Иштин жогорку натыйжалуулугу: Камтылган 9600 ПТР термикалык цикли, 96 үлгүнү автоматтык түрдө жана синхрондуу түрдө күчөтүү жана сандык эсептөөнү аяктоо үчүн компьютер 1ден 2 саатка чейин башкарылат.④ Гель электрофорезинин кереги жок: үлгүнү суюлтуунун жана электрофорездин кереги жок, жөн гана реакция түтүгүнөн түздөн-түз аныктоо үчүн атайын зондду колдонуңуз.⑤ Түтүктө булгануу жок: уникалдуу толугу менен жабык реакция түтүгү жана фотоэлектрдик өткөргүч системасы кабыл алынган, ошондуктан булгануу жөнүндө тынчсыздануунун кереги жок.⑥Натыйжалар кайталанса болот: сандык динамикалык диапазон беш даражага чейин.Ошондуктан, бул технология ийгиликтүү иштелип чыккандан бери көптөгөн илимий изилдөөчүлөр тарабынан бааланып, көптөгөн тармактарда колдонулуп келет.
2 Принциптер жана методдор
FQ-ПТРдин иштөө принциби ПТР реакциясынын системасына флуоресценттик белгиленген зондду кошуу үчүн Taq ферментинин 5′→3′ экзонуклеаза активдүүлүгүн колдонуу болуп саналат.Зонд атайын праймер ырааттуулугунда камтылган ДНК шаблону менен гибриддештире алат.Зонддун 5′ учу флуоресценттик эмиссия гени FAM (6-карбоксифлуоресцеин, флуоресценттик эмиссиянын чокусу 518нм) менен белгиленет, ал эми 3′учу флуоресценцияны өчүрүү тобу TAMRA (6-карбокситетраметилродамин, флуоресценция 38 нм) менен белгиленет. ПЦР күчөтүү учурунда зонддун узартылышына жол бербөө үчүн фосфорланган.Зонд бүтүн бойдон калганда, өчүрүүчү топ эмитенттүү топтун флуоресценттик эмиссиясын басат.Эмитенттик топ өчүрүү тобунан бөлүнгөндөн кийин, бөгөт коюу көтөрүлүп, 518 нм оптикалык тыгыздык көбөйөт жана флуоресценттик аныктоо системасы тарабынан аныкталат. Ренатурация фазасында зонд ДНК шаблону менен гибриддешет, ал эми узартуу фазасындагы Taq ферменти ДНКнын кеңейтүүчүсү менен темплата менен жылат.Зонд кесилгенде, өчүрүү эффектиси чыгып, флуоресценттик сигнал чыгарылат.Үлгү көчүрүлгөн сайын, флуоресценттик сигналдын чыгышы менен коштолгон зонд өчүрүлөт.Чыгарылган флюорофорлордун саны менен ПТР продуктуларынын санынын ортосунда бирден-бир байланыш бар болгондуктан, бул ыкманы шаблондун санын так аныктоо үчүн колдонсо болот.Эксперименталдык аспап жалпысынан PE компаниясы тарабынан иштелип чыккан ABI7100 ПТР термикалык циклдерин колдонот жана башка термикалык циклерлер да колдонулушу мүмкүн.Эксперимент үчүн ABI7700 реакция тибиндеги реакция системасы колдонулса, реакция аяктагандан кийин, сандык натыйжалар түздөн-түз компьютердик анализ аркылуу берилиши мүмкүн.Эгерде сиз башка термикалык циклдерди колдонсоңуз, RQ+, RQ-, △RQ эсептөө үчүн реакция түтүкчөсүндөгү флуоресценция сигналын өлчөө үчүн бир эле учурда флуоресценттик детекторду колдонушуңуз керек.RQ+ үлгү түтүкчөсүнүн флуоресценттик эмиссия тобунун люминесценция интенсивдүүлүгүнүн өчүрүү тобунун люминесценция интенсивдүүлүгүнө карата катышын билдирет, RQ- бош түтүктөгү экөөнүн катышын билдирет, △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) флуоресценттик процесстин жүрүшүндө алынган флюоресценттик натыйжалардын көлөмүн билдирет.Флуоресценттик зонддорду киргизуунун эсебинен эксперименттин специфика-лыктыгы бир кыйла жакшырды.Зонддун конструкциясы жалпысынан төмөнкү шарттарга жооп бериши керек: ①Зонддун узундугу 20-40 негиз болушу керек.②Бир нуклеотиддик тизмектердин кайталанышын болтурбоо үчүн GC негиздеринин мазмуну 40% жана 60% ортосунда.③ Гибриддештирүүдөн же праймерлер менен бири-бирине дал келүүдөн качыңыз.④ Зонд менен шаблондун ортосундагы байланыштын туруктуулугу праймер менен шаблондун ортосундагы байланыштын туруктуулугунан жогору, ошондуктан зонддун Tm мааниси праймердин Tm маанисинен кеминде 5°C жогору болушу керек.Мындан тышкары, зонддун концентрациясы, зонд менен шаблондун ырааттуулугунун ортосундагы гомология жана зонд менен праймердин ортосундагы аралыктын бардыгы эксперименттин натыйжаларына таасирин тийгизет.
Тектеш продуктылар:
Кытай реалдуу убакыт ПТР Easyᵀᴹ-Taqman Өндүрүүчү жана камсыздоочу |Foregene (foreivd.com)
Посттун убактысы: 2021-жылдын 15-октябрына чейин
