Молекулярдык диагностика технологиясы молекулярдык биология ыкмаларын колдонот, адамдын денесинин генетикалык материалынын жана ар кандай патогендердин түзүмүн аныктоо жана ооруларды алдын алуу жана диагностикалоо максатына жетүү үчүн.

Акыркы жылдары, молекулярдык диагностика технологиясын өркүндөтүү жана кайталоо менен молекулярдык диагностиканын клиникалык колдонулушу барган сайын кеңири жана терең болуп, молекулярдык диагностика рыногу тез өнүгүү мезгилине кирди.

Автор рынокто кеңири таралган молекулярдык диагностикалык технологияларды жалпылап, үч бөлүккө бөлүнөт: биринчи бөлүктө ПТР технологиясы, экинчи бөлүктө нуклеиндик кислотанын изотермикалык күчөтүү технологиясы, экинчи бөлүгү секвенирлөө технологиясы менен тааныштырат.

01

I бөлүм: ПТР технологиясы

ПЦР технологиясы

ПТР (полимераздык чынжыр реакциясы) 30 жылдан ашык тарыхы бар ДНКны күчөтүү in vitro технологияларынын бири болуп саналат.

ПТР технологиясын 1983-жылы АКШдагы Кетустан Кари Муллис киргизген.Муллис 1985-жылы ПЦР патентине кайрылган жана ошол эле жылы Илим боюнча биринчи ПТР академиялык документин жарыялаган.Муллис 1993-жылы химия боюнча Нобель сыйлыгын алган.

ПЦРдин негизги принциптери

ПТР максаттуу ДНК фрагменттерин миллиондон ашык эсеге көбөйтө алат.Принцип ДНК полимеразанын катализинде ДНКнын ата-эне тилкеси шаблон катары колдонулат, ал эми белгилүү бир праймер узартуу үчүн баштапкы чекит катары колдонулат.Ал денатурация, күйдүрүү жана узартуу сыяктуу кадамдар аркылуу in vitro репликацияланат.ДНКнын ата-эне тилкесинин шаблонуна толуктоочу кыз тилкесинин ДНК процесси.

Стандарттык ПТР процесси үч баскычка бөлүнөт:

1. Денатурация: ДНКнын кош жиптерин бөлүү үчүн жогорку температураны колдонуңуз.ДНКнын кош тилкелеринин ортосундагы суутек байланыштары жогорку температурада (93-98°С) үзүлөт.

2. Күйдөтүү: Кош тизмектүү ДНК бөлүнгөндөн кийин, праймер бир тилкелүү ДНКга байланыша алгыдай кылып, температура төмөндөтүлөт.

3. Кеңейтүү: ДНК полимераза температураны төмөндөткөндө байланышкан праймерлерден ДНК тилкелери боюнча комплементарлык тилкелерди синтездей баштайт.Кеңейтүү аяктаганда бир цикл бүтөт жана ДНК фрагменттеринин саны эки эсеге көбөйөт.

Бул үч кадамды 25-35 жолу кайталаса, ДНК фрагменттеринин саны экспоненциалдуу түрдө көбөйөт.

ПЦРдин тапкычтыгы – ар кандай праймерлердин ар кандай максаттуу гендер үчүн иштелип чыгышы, ошону менен максаттуу ген фрагменттери кыска убакыттын ичинде күчөтүлүшү мүмкүн.

Буга чейин, ПТР үч категорияга бөлүүгө болот, атап айтканда, жөнөкөй ПТР, флуоресценттик сандык ПТР жана санариптик ПТР.

Кадимки ПТРдин биринчи мууну

Максаттуу генди күчөтүү үчүн кадимки ПТР күчөтүү инструментин колдонуңуз, андан кийин продуктуну аныктоо үчүн агароз гел электрофорезин колдонуңуз, сапаттык анализди гана жасоого болот.

Биринчи муундагы ПТРдин негизги кемчиликтери:

-спецификалык эмес күчөтүү жана жалган оң натыйжаларга жакын.

-Аныктоо узакка созулуп, операция түйшүктүү.

-Сапаттык тестирлөө гана жүргүзүлүшү мүмкүн.

Экинчи муундагы флуоресценттик сандык ПТР

Флуоресценттик сандык ПТР (Real-Time PCR), ошондой эле qPCR катары белгилүү, реакция системасынын жүрүшүн көрсөтө турган флуоресценттик зонддорду кошуу менен флуоресценттик сигналдардын топтолушу аркылуу күчөтүлгөн продуктулардын топтолушун көзөмөлдөө жана флуоресценция ийри сызыгы аркылуу жыйынтыктарды баалоо үчүн колдонулат, жана Кванттык жана стандарттык кыйшык сызыктын жардамы менен.

qPCR технологиясы жабык системада ишке ашырылгандыктан, булгануу ыктымалдыгы азаят жана флуоресценттик сигнал сандык аныктоо үчүн көзөмөлдөнүшү мүмкүн, ошондуктан ал клиникалык практикада эң кеңири колдонулат жана ПТРде басымдуу технология болуп калды.

реалдуу убакыт флуоресценттик сандык ПТРде колдонулган флуоресценттик заттарды бөлүүгө болот: TaqMan флуоресценттик зонддору, молекулярдык маяктар жана флуоресценттик боёктор.

1) TaqMan флуоресценттик зонд:

ПТР күчөтүү учурунда, бир жуп праймерди кошуу менен белгилүү бир флуоресценттик зонд кошулат.Зонд олигонуклеотид болуп саналат жана эки учу тиешелүүлүгүнө жараша репортер флуоресценттик тобу жана өчүрүүчү флуоресценттик топ менен белгиленет.

Зонд бүтүн болгондо, кабарчылар тобу чыгарган флуоресценттик сигналды өчүрүү тобу сиңирет;ПТР күчөтүү учурунда, Taq ферментинин 5′-3′ экзонуклеаза активдүүлүгү зондду бөлүп, начарлатат, бул флуоресценттик топтун флуоресценттик тобун ажыратат, ошентип флуоресценттик мониторинг системасы флуоресценттик сигналды кабыл алат, б.а. сигнал ПТР продуктунун пайда болушу менен толугу менен синхрондоштурулган.

2) SYBR флуоресценттик боёктор:

ПЦР реакция системасында ашыкча SYBR флуоресценттик боёк кошулат.SYBR флуоресценттик боёгу спецификалык эмес ДНКнын кош тизмегине киргизилгенден кийин, ал флуоресценттик сигналды чыгарат.Чынжырга кирбеген SYBR боёк молекуласы флуоресценттик сигналды чыгарбайт, ошентип флуоресценттик сигналды камсыздайт. ПТР продуктуларынын көбөйүшү ПТР продуктуларынын көбөйүшү менен толугу менен синхрондоштурулган.SYBR эки саптуу ДНК менен гана байланышат, ошондуктан эрүү ийри сызыгы ПТР реакциясынын өзгөчөлүгүн аныктоо үчүн колдонулушу мүмкүн.

3) Молекулярдык маяктар

Бул 5 жана 3 учунда болжол менен 8 негиздерден турган чач кычкач түзүлүшүн түзгөн өзөк-улак кош белгиси бар олигонуклеотиддик зонд.Нуклеиндик кислотанын эки учундагы тизмеги толуктап жупташып, флуоресценттик топ менен өчүрүүчү топтун тыгыз болушун шарттайт.Жабуу, ал флуоресценция чыгарбайт.

ПТР продуктусу түзүлгөндөн кийин, күйгүзүү процессинде молекулярдык маяктын ортоңку бөлүгү белгилүү ДНК ырааттуулугу менен жупталат жана флуоресценттик ген флуоресценцияны өндүрүү үчүн өчүрүүчү генден бөлүнөт.

Экинчи муундагы ПТРдин негизги кемчиликтери:

Сезимталдуулук дагы эле жок, ал эми аз нускадагы үлгүлөрдү аныктоо так эмес.

Фондук баалуулук таасири бар, натыйжада кийлигишүүгө дуушар болот.

Үчүнчү муундагы санариптик ПТР

Санарип ПТР (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) акыркы чекиттик аныктоо аркылуу максаттуу катардын көчүрмөсүн эсептейт жана ички контролдорду жана стандарттык ийри сызыктарды колдонбостон так абсолюттук сандык аныктоону жүргүзө алат.

Санарип ПТР акыркы чекитти аныктоону колдонот жана Ct маанисинен (цикл босогосу) көз каранды эмес, ошондуктан санариптик ПТР реакциясы күчөтүү эффективдүүлүгүнө азыраак таасир этет, ал эми ПТР реакциясынын ингибиторлоруна толеранттуулук жакшыртылып, жогорку тактык жана кайталануучулук.

Жогорку сезгичтиктин жана жогорку тактыктын өзгөчөлүктөрүнөн улам, ага ПЦР реакциясынын ингибиторлору оңой кийлигишпейт жана стандарттуу продуктуларсыз чыныгы абсолюттук сандык аныктоого жетише алат, бул изилдөө жана колдонуу түйүнү болуп калды.

Реакция бирдигинин ар кандай формалары боюнча үч түргө бөлүнөт: микрофлюиддик, чиптик жана тамчы системалары.