1. РНК эритмесинин абсорбенциясын табыңыз
280, 320, 230 жана 260 нм абсорбция тиешелүүлүгүнө жараша нуклеин кислотасынын, фондун (эритмедин булуңдуулугу), туздун концентрациясынын жана белок сыяктуу органикалык заттардын маанилерин билдирет.Жалпысынан OD260/OD280ди гана караңыз (Ratio, R).1,8 ~ 2,0 болгондо, РНКдагы белоктун же башка органикалык заттардын булгануусуна жол берилиши мүмкүн деп ойлойбуз, бирок Трис абсорбенцияны аныктоо үчүн буфер катары колдонулганда, R мааниси 2ден жогору болушу мүмкүн экенин белгилей кетүү керек (негизинен <2,2 болушу керек).R<1,8 болгондо эритмедеги белоктун же башка органикалык заттардын булганышы айкыныраак болуп, РНКнын тагдырын муктаждыктарга жараша аныктоого болот.R>2,2 болгондо, бул РНК бир нуклеин кислотасына гидролизденгендигин билдирет.
2. РНКнын электрофоретикалык схемасы
Негизинен РНК электрофорези үчүн денатурациялоочу гель колдонулат, бирок ал РНКнын сапатын аныктоо үчүн гана болсо, денатурациялоочу гелдин кереги жок жана кадимки агароздук гелди колдонсо болот.Электрофорездин максаты - 28S жана 18S тилкелеринин бүтүндүгүн жана алардын катышын, же мРНК мазынын бүтүндүгүн аныктоо.Жалпысынан, 28S жана 18S тилкелери жаркыраган, ачык-айкын жана курч (тилкелердин четтерине карата айтылган) болсо жана 28S жарыктыгы 18S тилкесинен эки эсе көп болсо, РНКнын сапатын жакшы деп эсептейбиз.
Жогоруда биз көбүнчө колдонгон эки ыкма болуп саналат, бирок бул эки ыкманын бири да РНК эритмесинде калдык RNase бар же жок экенин так айта албайт.Эгерде эритмеде RNase өтө аз санда болсо, аны жогорудагы ыкма менен аныктоо биз үчүн кыйын, бирок кийинки ферменттик реакциялардын көбү 37 градустан жогору жана узак убакытка чейин жүргүзүлөт.Ушундайча, РНК эритмесинде өтө аз сандагы RNase бар болсо, анда кийинки эксперименттерде алардын ролун ойноого абдан ылайыктуу чөйрө жана убакыт болот жана албетте бул учурда эксперимент суук болот.Төмөндө биз РНК эритмесинде калдык RNase бар же жок экенин тастыктай турган ыкманы киргизебиз.
3. Жылуулукту сактоо сыноосу
Үлгү концентрациясына ылайык, РНК эритмесинен эки 1000 нг РНКны алып, аны 0,5 мл центрифуга түтүгүнө кошуп, жалпы көлөмү 10 ул болгон рН 7,0 Трис буфери менен толуктаңыз, андан кийин түтүктүн капкагын бекитиңиз.Алардын бирин 70°С туруктуу температурадагы суу ваннасына салып, 1 саат жылуу кармаңыз.Калган бөлүгү -20°С муздаткычта 1 саатка сакталган.Убакыт бүткөндө, электрофорез үчүн эки үлгүнү алып салыңыз.Электрофорез аяктагандан кийин, экөөнүн электрофорездик тилкелерин салыштырыңыз.Эгерде экөөнүн тилкелери ырааттуу болсо же олуттуу айырмачылыктары жок болсо (албетте, алардын тилкелери да 2-ыкмадагы шарттарга жооп берсе), бул РНК эритмесинде РНазанын калдыктары жок экенин жана РНКнын сапаты абдан жакшы экендигин билдирет.Тескерисинче, 70°C инкубацияланган үлгү айкын деградацияны көрсөтсө, бул РНК эритмесинде RNase булганышы бар экенин көрсөтөт.
2 РНКны экстракциялоонун эксперименталдык ыкмалары жана ыкмалары
РНКны экстракциялоодо биз көп жолуга турган көйгөйлөр: (1) РНКнын түшүмдүүлүгү төмөн;(2) РНКнын туздун олуттуу булганышы бар;(3) РНК олуттуу органикалык эриткичтин булганышы бар;(4) үлгүдөгү деградация жана башка көйгөйлөр
1. Кеңири колдонулуучу жалпы РНК экстракциялоочу реагенттер
Гуанидин-изотиоцианат ыкмасы жана Тризол ыкмасы жаныбарлардын ткандарынан жана жаныбарлардын клеткаларынан жалпы РНКны алуу үчүн эң көп колдонулган ыкмалар болуп саналат.Бул, мисалы, коёндун терисинен жана жаныбарлардын тутумдаштыргыч тканынан жалпы РНКны алуу сыяктуу бөлүп алуу өзгөчө кыйын болгон кичинекей үлгүлөр жана кыртыштар үчүн өзгөчө ылайыктуу;Мындан тышкары, Trizol, жалпы максаттагы лизис реагент катары, ошондой эле өсүмдүк ткандарын, бактерияларды, козу карындарды жана башка кыртыштарды алуу үчүн колдонулушу мүмкүн.Камелия олейферасы, чай жалбырактары, рапс жана башкалар сыяктуу полисахариддерди жана полифенолдорду камтыган өсүмдүк ткандары үчүн CTAB ыкмасы жалпы РНКны алуу үчүн да колдонулушу мүмкүн.
Кадимки ыкма катары кош мамычалуу ыкма да кадимки температурада иштөөсү, RNase кошуунун кереги жок жана коопсуздугу — хлороформ, фенолдор жана экстракция үчүн башка органикалык реагенттер жок болгондуктан абдан популярдуу.(сунушталган продуктылар )
2. Жаныбарлардын ткандарынан жалпы РНКны бөлүп алуу
(1) Жаңы кыртышты тандоого аракет кылыңыз, эгер ал жаңы эмес болсо (үч айдын ичинде - 80 ℃ муздаткычта же суюк азотто тоңдурулган. Кырканы кесип жатканда бөлмө температурасында түз кеспеңиз, аны муз кутусуна коюуну унутпаңыз, кайра-кайра тоңдуруудан жана эрүүдөн сактанууга аракет кылыңыз.
(2) Кичинекей кыртышты кесүү үчүн таза кайчы жана кычкачты колдонуңуз, үлгүнү кесип жатканда кыртыштын борбордук бөлүгүн кесүүгө аракет кылыңыз, же адегенде ортосунан чоң кыртышты кесип, андан кийин үлгүнү жаңы кесилген жерде кесип алыңыз.Алынган кыртыш толугу менен майдаланып, майдаланган тканды RNase жок EP түтүкчөсүнө салып, лизат кошуп, майдаланган кыртыш толугу менен лизатка тийип, гомогенизацияга даярдалышы керек.
(3) Кадимки кыртыштар үчүн, гомогенизациялоо үчүн маш буурчак өлчөмүндөгү ткандарды (30-60 мг) тандаңыз.Эгерде ткандарда көп сандагы белок, май же тыгыз жипчелүү ткандар бар болсо, мисалы, боор, кесилген ткандардын санын ылайыктуу түрдө көбөйтүңүз же азайтыңыз (милдеттүү эмес) 10~20 мг тандаңыз).
(4) Эгерде балыктын булчуңдары, чаяндардын эти, медузалар жана башка ткандар жогорку суу менен алынса, үлгү көлөмүн тийиштүү түрдө көбөйтүү керек (100-200 мг сунушталат).
(5) Эгерде шарттар уруксат берсе, жаныбарлардын кыртышы жогорку өтүүчү ткань гомогенизатору менен гомогенизациялангандан кийин, эгерде мындай жабдуулар жок болсо, түздөн-түз экстракцияланышы мүмкүн.
(6) Акыркы экстракциядан кийин алынган РНК РНКнын бузулушун азайтуу үчүн дароо муз кутусуна коюлушу керек.
3. Жаныбар клеткасынын РНКсын алуу
(1) Суспензия клеткалары: түздөн-түз центрифугалоо жана чөйрөнү ыргытуу, стерилдүү PBS менен 1-2 жолу жуу, андан кийин тиешелүү өлчөмдөгү PBS менен суспензия, андан кийин лизис үчүн лизат кошуу.Суюктукту толугу менен ыргытып салгандан кийин лизатты туздалган клеткаларга кошпоңуз.Бул сырткы катмардагы лизиденген клеткалардан кийин чыгарылган гистон пакетинин чөккөн клеткалардын сыртына жабышып калышына алып келет, ошону менен гранул ичиндеги клеткалардын лизат менен байланышын чектейт., натыйжада клетканын толук эмес лизиси жана РНКнын түшүмдүүлүгү азаят.
(2) жарым-жартылай жабышкан же бекем карманбаган клеткалар: чөйрөнү ыргытып салгандан кийин, PBS менен 1-2 жолу жууп, андан кийин түздөн-түз тиешелүү сандагы PBS соруп, клеткаларды үйлөө үчүн пипетка же мылтык менен маданият табагын үйлөп, аларды РНКсы жок клеткаларга өткөрүп бериңиз.Лизатты экстракциялоо үчүн ферменттин EP түтүкчөсүнө кошуңуз.
(3) Жабышкан клеткалар: адегенде трипсин менен сиңирүү керек, андан кийин RNase-эркин EP түтүктөрүнө чогултулуп, үстүнкү затты алып салуу үчүн центрифугадан өткөрүлөт, ашыкча трипсинди алып салуу үчүн PBS менен 1-2 жолу жууп, PBS тиешелүү өлчөмдө кайра суспензияланат. Андан кийин экстракция баскычына өтүңүз.
4. Өсүмдүк РНКсын экстракциялоо
Өсүмдүк ткандары фенолдук бирикмелерге бай, же полисахариддерге бай, же кээ бир аныкталбаган экинчилик метаболиттерди камтыйт же RNase жогорку активдүүлүгүнө ээ.Бул заттар клетка лизистен кийин РНК менен тыгыз биригип, эрибеген комплекстерди же коллоиддик чөкмөлөрдү пайда кылат, аларды алып салуу кыйын.Ошондуктан, биз өсүмдүк кыртышын алып жатканда, биз өсүмдүктөр үчүн комплект тандоо керек.Комплекттеги лизат полифенолдорду жеңил кычкылдантуу жана полисахариддик бирикмелерди жана нуклеин кислоталарын бөлүү маселелерин эффективдүү чече алат.
(Полисахарид полифенол өсүмдүк РНК экстракциясы үчүн, сунушталган продуктулар:
(1) Өсүмдүктүн кабыгы, целлюлозасы, уруктары, жалбырактары ж.б.Майдалоо процессинде суюк азот үлгүнү эрип кетпеш үчүн өз убагында толукталышы керек.Жерден алынган үлгү тез арада лизатка кошулуп, РНК деградациясын болтурбоо үчүн чайкалышы керек.
(2) Күрүч жана буудай жалбырактары сыяктуу жипчеге бай үлгүлөр үчүн экстракциянын көлөмүн тиешелүү түрдө азайтуу керек, антпесе кыртыштын майдалоосу жана лизиси толук болбойт, натыйжада алынган РНКнын аз түшүмдүүлүгү болот.
(3) Анар мөмөсү, дарбыз мөмөсү, шабдалы мөмөсү ж.б. сыяктуу жогорку суунун мазмуну бар өсүмдүк кыртыштары үчүн үлгүнүн өлчөмү тиешелүү түрдө көбөйтүлүшү керек (100-200 мг милдеттүү эмес).
(4) Өсүмдүк ткандары, мисалы, өсүмдүк жалбырактары, тамырлар, катуу мөмөлөр жана башка материалдар, адатта, ингредиенттерди эритмеде жакшылап эритиш үчүн суюк азотту колдонуу сунушталат, андан кийин экстракция баскычына өтүңүз.Кадимки кыртыш гомогенизаторлору өсүмдүк ткандарын гомогенизациялоодо эффективдүү болбой калышы мүмкүн жана көбүнчө сунушталбайт.
5. РНКны экстракциялоодо сактык чаралары
(1) Тоңдуруу жана эрүү кайталанбоо үчүн кыртыштын үлгүлөрү мүмкүн болушунча жаңы болушу керек.
(2) Экстракция учурунда кыртыш толугу менен майдаланган болушу керек жана кыртыштын көлөмү өтө аз эмес, өтө көп болбошу керек.
(3) Лизат кошулгандан кийин үлгүнү толук лизис үчүн жетиштүү инкубация убактысы берилиши керек.
(4) Экстракция үчүн Trizol ыкмасын колдонууда, стратификациядан кийин супернатантты сиңирүү принциби "көбүрөөк дем алуудан азыраак дем алуу" болуп саналат жана ортоңку катмарга экстракцияланбашы керек, антпесе ДНКнын олуттуу геномдук булгануусуна алып келет.
(5) Жуунуп жатканда, кылдат жуулууну камсыз кылуу үчүн жуугуч суюктук түтүк дубалынын айланасына толугу менен инфильтрацияланышы керек.
(6) Колонканы экстракциялоо ыкмасы үчүн, жуугандан кийин мамыны ажыратуудан тышкары, адсорбциялык мамычаны да өтө таза отургучка жайгаштыруу жана органикалык эриткичти кургакчылыкка чейин толугу менен буулантуу үчүн 5-10 мүнөт үйлөө керек.
(7) Колонна ыкмасынын акыркы элюциясында DEPC суусун кошкондон кийин аны 3-5 мүнөт инкубациялоо керек, же DEPC суусун алдын ала 60°Сге чейин ысытуу керек, элюциянын түшүмүн жогорулатуу.Салттуу Тризолду бөлүү жана изопропанолду чөктүрүүдө акыркы РНК DEPC суусунда эрийт, ошондуктан эритүү үчүн тиешелүү убакыт берилип, центрифуга түтүгүнүн түбүн пипетка учу менен үзгүлтүксүз үйлөтүп туруу керек.
3 ТТөмөн РНК концентрациясынын себептери жана чечимдери
1. Түшүмдүүлүк өтө төмөн
алынган үлгү өтө төмөн, жалпы суммасы жетишсиз, же алынган үлгү өтө көп жана лизис толук эмес;экстракция үчүн тиешелүү сапаттагы кыртыш же клеткалар колдонулушу керек, үлгүнүн алдын ала дарылоо жакшы жүргүзүлүшү керек жана лизис жетиштүү болушу керек.
2. Геном калдыктары
Тризол ыкмасы менен экстракциялоодо, үстүнкү катмар катмарлангандан кийин ортоңку катмарга сорулганда геномдун олуттуу булгануусу пайда болот;Ортоңку катмарга соруп албаш үчүн катмарлоодо өзгөчө кылдаттык керек.Эгерде экстракция үчүн мамыча ыкмасы колдонулса, DNase I камтыган комплект экстракция үчүн тандалышы мүмкүн.Мембранада адсорбцияланган нуклеин кислотасы түздөн-түз DNase I менен сиңирилип, ДНК калдыктарын бир топ азайтат.
3. РНКнын бузулушу
Бул алынган үлгүнүн өзүнүн деградациясы же экстракция процессинде пайда болгон деградация болушу мүмкүн;мүмкүн болушунча жаңы үлгүлөрдү РНКны экстракциялоо үчүн колдонуу керек, ал эми чогултулган үлгүлөрдү суюк азотто же -80°C муздаткычта убагында сактоо жана кайра-кайра тоңдуруу жана эритүүдөн качуу керек.РНК/ДНазсыз учтар, центрифуга түтүктөрү жана башка материалдар РНКны экстракциялоо процессинде колдонулушу керек.казып алуу жараяны мүмкүн болушунча тез болушу керек.Алынган РНК муз кутусуна салынып, убагында -80 сакталышы керек.Эгерде экстракцияланган РНКны гелдик электрофорез менен аныктоо керек болсо, экстракциядан кийин дароо электрофорез жүргүзүү керек, ал эми электрофорез буферин жаңы даярдалганга алмаштыруу керек.
4. Туз жана органикалык эриткичтин калдыктары
Экстракция реагенттеринде фенол жана гуанидин туздары, ал эми жуугуч эритмеде этанол бар.Экстракциялоо процессинде лизат толук сиңирилбеген жана ташталбаган, жуугуч эритме толук кургатылган эмес.Калган туздар жана органикалык эриткичтер кийинки тескери транскрипцияга жана ПТРге зыяндуу.Ингибирлөөнүн ар кандай даражалары, ошондуктан ткандардын лизаты экстракция процессинде толугу менен алынып салынышы керек, ал эми жуугуч түтүктүн курчап турган дубалдарын жууй тургандай болушу керек.Мындан тышкары, түтүктү бошотуп, үйлөтүү органикалык заттардын калдыктарын андан ары азайта турган зарыл кадам болуп саналат.
РНК алуу жөнүндө көбүрөөк маалымат алуу үчүн, биздин веб-сайтка кириңиз:
Көбүрөөк маалымат алуу үчүн www.foreivd.com.
Посттун убактысы: 2022-жылдын 1-декабрына чейин
