• facebook
  • linkedin
  • youtube

ПТР эң кеңири колдонулган нуклеин кислотасын күчөтүү технологиясы жана анын сезгичтиги жана өзгөчөлүгүнөн улам кеңири колдонулат.Бирок, ПЦР кайталануучу термикалык денатурацияны талап кылат жана инструменттерге жана жабдууларга таянуудагы чектөөлөрдөн арыла албайт, бул анын клиникалык талаа сыноолорунда колдонулушун чектейт.

1990-жылдардын башынан бери көптөгөн лабораториялар жылуулук денатурациясын талап кылбаган температураны туруктуу күчөтүү технологиясын иштеп чыга башташты.Азыр алар цикл аркылуу изотермикалык күчөтүү технологиясын, жипти алмаштыруучу изотермикалык күчөтүү технологиясын, айланма айлананын изотермикалык күчөтүү технологиясын жана нуклеиндик кислотанын ырааттуулугуна көз карандылыгын иштеп чыгышты.изотермикалык күчөтүү технологиясы жана башка технологиялар. 

Loop-аралык изотермиялык күчөтүү

Күчөтүү принциби ДНКнын болжол менен 65°С динамикалык тең салмактуулук абалында болушуна негизделген.Качан кандайдыр бир праймер базалык жупташып, эки тилкелүү ДНКнын комплементарлык бөлүгүнө чейин узартылганда, экинчи тилке диссоциацияланып, бир тилкелүү болуп калат.

Бул температурада ДНК 4 өзгөчө праймерди колдонот, бул сапты жылдыруу ДНК полимеразасына таянуу үчүн, сап-кыштоо ДНКсынын синтезин тынымсыз айлантып турат.

Алгач максаттуу гендеги 6 конкреттүү аймакты F3, F2, F1, B1, B2, B3 аныктаңыз, андан кийин ушул 6 белгилүү аймактын негизинде 4 праймерди долбоорлаңыз (төмөндөгү сүрөттө көрсөтүлгөндөй):

Алдыңкы ички праймер (FIP) F1c жана F2ден турат.

Арткы ички праймер (BIP) B1c жана B2ден турат, ал эми TTTT ортодогу боштук катары колдонулат.

F3 жана B3 сырткы праймерлери максаттуу гендеги F3 жана B3 аймактарынан турат.

Нуклеин кислотасынын изотермикалык күчөтүү технологиясы

LAMP реакция системасында ички праймердин концентрациясы сырткы праймерден бир нече эсе көп.Ички праймер адегенде шаблон тилкеси менен биригип, ДНКнын кош тилкесин түзүү үчүн комплементарлык жипти синтездейт.Кийинчерээк, тышкы праймер ДНКнын кош тилкесин түзүү үчүн шаблон тилкеси менен бириктирилет.БстДНК полимеразанын таасири астында ички праймер тарабынан синтезделген комплементарлык жип бөлүнүп чыгат.Бир катар реакциялардан кийин толуктоочу тил акыры гантелдик түзүлүшкө ээ бир ДНК тилкесин түзөт.

Гантелдин түзүлүшү ДНКнын бир жипчеси ачык учу менен үзгүлтүксүз өтмө өзөк-улак түзүмүн ДНКны түзүү үчүн шаблон катары колдонулат.Ички жана сырткы праймерлер өткөөл дөңгөлөк түзүмүнүн ДНКсын үзгүлтүксүз жиптин жылышына жана узартылышына алып барат жана акырында ар кандай узундуктагы бир нече өзөк-улак структураларын түзүшөт.ДНК аралашмасы.

Нуклеин кислотасынын изотермикалык күчөтүү технологиясы2

Укмуштуу изотермикалык күчөтүүнүн артыкчылыктары жана кемчиликтери

LAMP артыкчылыктары:

(1) 1 сааттын ичинде максаттуу гендин 1-10 көчүрмөсүн эффективдүү күчөтө турган жогорку күчөтүү эффективдүүлүгү жана күчөтүү эффективдүүлүгү кадимки ПТРден 10-100 эсе жогору.

(2) Реакция убактысы кыска, өзгөчөлүгү күчтүү жана атайын жабдуулар талап кылынбайт.

LAMP кемчиликтери:

(1) Праймерлерге талаптар өзгөчө жогору.

(2) Күчөтүлгөн продукт клондоштуруу жана секвенирлөө үчүн колдонулушу мүмкүн эмес, бирок чечим чыгаруу үчүн гана колдонулушу мүмкүн.

(3) Күчтүү сезгичтигинен улам, аэрозолдорду түзүү оңой, жалган позитивдерди пайда кылат жана сыноонун натыйжаларына таасир этет.

Sтрансплантацияны күчөтүү

Страндын жылышын күчөтүү (SDA) 1992-жылы америкалык окумуштуу Уокер тарабынан биринчи жолу сунушталган ферменттик реакцияга негизделген in vitro изотермиялык ДНКны күчөтүү ыкмасы.

SDAнын негизги системасы чектөөчү эндонуклеазаны, жипти алмаштыруу активдүүлүгү бар ДНК полимеразаны, эки жуп праймерди, dNTPs, кальций жана магний иондору жана буфердик системаларды камтыйт.

Спирттин жылышын күчөтүү принциби максаттуу ДНКнын эки учундагы химиялык жактан өзгөртүлгөн чектөөчү эндонуклеазаны таануу ырааттуулугуна негизделген.Эндонуклеаза анын таануу жеринде ДНК тилкесиндеги боштукту ачат, ал эми ДНК полимеразасы боштукту узартат 3′ End жана кийинки ДНК тилкесин алмаштырат.

ДНКнын алмаштырылган бир тилкелери праймерлер менен биригип, ДНК полимераза аркылуу кош тилкелерге узартылышы мүмкүн.Бул процесс үзгүлтүксүз кайталанат, ошондуктан максаттуу ырааттуулук натыйжалуу күчөтүлөт.

Нуклеин кислотасынын изотермикалык күчөтүү технологиясы3

Артыкчылыктары жана жипти жылдырууну күчөтүү технологиясынын кемчиликтери

SDA артыкчылыктары:

Күчөтүү натыйжалуулугу жогору, реакция убактысы кыска, өзгөчөлүгү күчтүү жана атайын жабдуулар талап кылынбайт.

SDA кемчиликтери:

Продукциялар бирдей эмес, кээ бир бир саптуу жана эки жиптүү продуктулар дайыма SDA циклинде өндүрүлөт жана электрофорез менен аныкталганда сөзсүз түрдө калдыктар пайда болот.

Rоллинг чөйрөсүн күчөтүү

Rolling circuit amplification (RCA) патогендик организмдерден ДНКны айланма тегерек аркылуу көчүрүү ыкмасына таянуу менен сунушталат.Бул туруктуу температурада калып катары бир саптуу тегерек ДНКны колдонууну билдирет жана атайын ДНК полимераза (мисалы, Phi29) ) Максаттуу гендин күчөшүнө жетүү үчүн айланма айланма ДНК синтезинин аракети астында.

RCA сызыктуу күчөтүү жана экспоненциалдык күчөтүү деп бөлүүгө болот.Сызыктуу RCA натыйжалуулугу 10 жетиши мүмкүн5эсе, жана экспоненциалдык RCA натыйжалуулугу 10 жетиши мүмкүн9жолу.

Жөнөкөй айырмалоо, төмөндөгү сүрөттө көрсөтүлгөндөй, сызыктуу күчөтүү a 1 праймерди гана колдонот, экспоненциалдык күчөтүү b 2 праймерге ээ.

Нуклеин кислотасынын изотермикалык күчөтүү технологиясы4

Сызыктуу RCA да бир праймер RCA деп аталат.Праймер тегерек ДНК менен байланышат жана ДНК полимеразанын аракети менен узартылат.Продукт бир циклдин узундугунан миң эсе көп кайталануучу ырааттуулугу бар сызыктуу жалгыз жип.

Сызыктуу RCA продуктусу ар дайым баштапкы праймерге туташкандыктан, сигналдын оңой бекитилиши негизги артыкчылык болуп саналат.

Экспоненциалдык RCA, ошондой эле Гипер тармакталган күчөтүү HRCA (Гипер тармакталган RCA) катары белгилүү, экспоненциалдык RCAда, бир праймер RCA продуктусун күчөтөт, экинчи праймер RCA продуктусу менен гибриддешет жана кеңейет, ал эми алмаштыруу мурунтан эле RCA продуктусуна байланган.

Нуклеин кислотасынын изотермикалык күчөтүү технологиясы5

Айланадагы нуклеиндик кислотаны күчөтүүнүн артыкчылыктары жана кемчиликтери

RCA артыкчылыктары:

Жогорку сезгичтик, жакшы өзгөчөлүк жана жеңил иштетүү.

RCA кемчиликтери:

Сигналдарды аныктоо учурундагы көйгөйлөр.RCA реакциясы учурунда айланбаган кулпу зонд жана байланышпаган зонддун калыптуу ДНКсы же РНКсы кээ бир фондо сигналдарды жаратышы мүмкүн. 

Nнуклеициддердин ырааттуулугунун негизинде күчөтүү

Нуклеиндик кислотанын ырааттуулугуна негизделген күчөтүү (NASBA) – ПТРдин негизинде иштелип чыккан жаңы технология.Бул нуклеин кислотасынын үзгүлтүксүз жана изотермикалык күчөтүлүшү, T7 промоутер ырааттуулугу бар жуп праймерлер тарабынан жетекчиликке алынат.Технология шаблон РНКсын болжол менен 2 сааттын ичинде болжол менен 109 эсеге күчөтө алат, бул кадимки ПЦР ыкмасынан 1000 эсе жогору жана атайын жабдууларды талап кылбайт.

Бул технология пайда болоору менен ооруларды тез диагностикалоо үчүн колдонулган жана учурда көптөгөн компаниялар бул ыкманы РНКны аныктоочу шаймандарда колдонушат.

РНКны күчөтүү тескери транскрипциялуу ПТР технологиясын да колдонсо да, NASBAнын өзүнүн артыкчылыктары бар: ал салыштырмалуу туруктуу температура шарттарында жүргүзүлүшү мүмкүн жана ал салттуу ПТР технологиясына караганда туруктуу жана так.

Реакция 41 градус Цельсийде жана бүтүрүү үчүн AMV (канаттуулардын миелобластоз вирусу) тескери транскриптазасы, RNase H, T7 РНК полимеразасы жана бир жуп праймер талап кылынат.

Процесс негизинен төмөнкүлөрдү камтыйт:

Алдыдагы праймер T7 промоутеринин толуктоочу ырааттуулугун камтыйт.Реакция учурунда алдыдагы праймер РНК тилкеси менен байланышат жана ДНК-РНКнын кош тилкесин пайда кылуу үчүн AMV ферменти тарабынан катализделет.

RNase H гибриддик кош тилкедеги РНКны сиңирип, бир тилкелүү ДНКны сактап калат.

Тескери праймердин жана AMV ферментинин таасири астында T7 промотор ырааттуулугун камтыган ДНКнын кош тилкеси пайда болот.

T7 РНК полимеразасынын таасири астында транскрипция процесси аяктап, көп сандагы максаттуу РНК өндүрүлөт.

Нуклеин кислотасынын изотермикалык күчөтүү технологиясы6

NASBA артыкчылыктары:

(1) Анын праймеринде T7 промоутер ырааттуулугу бар, бирок чет өлкөлүк кош тилкелүү ДНКда T7 промотер ырааттуулугу жок жана аны күчөтүү мүмкүн эмес, ошондуктан бул технология жогорку өзгөчөлүккө жана сезгичтикке ээ.

(2) NASBA тескери транскрипция процессин күчөтүү реакциясына түздөн-түз киргизип, реакциянын убактысын кыскартат.

NASBA кемчиликтери:

(1) Реакция компоненттери татаалыраак.

(2) Реакцияны кымбаттатуу үчүн үч түрдүү фермент талап кылынат.


Посттун убактысы: 06-август-2021