COVID-19 – бул катуу кармаган респиратордук синдромдун 2-типтеги коронавирусунан келип чыккан жугуштуу оору. Адамга инфекция жуккан учурда эң кеңири таралган симптомдорго ысытма, жөтөл жана дем алуу кирет.
Сыноо үчүн колдонулган үлгүлөрдү назофарингеалдык тампондор же орофарингеалдык тампондор менен чогултса болот.
Коронавирусту аныктоонун стандарттуу ыкмасы - полимераздык чынжыр реакциясы, ПТР.Бул молекулярдык биологияда кеңири колдонулган ыкма.Ал миллиондогондон миллиарддаган белгилүү ДНК фрагменттерин тез арада көчүрө алат.
Жаңы коронавирус өтө узун бир саптуу РНК геномун камтыйт.Бул вирустарды ПТР аркылуу аныктоо үчүн РНК молекулалары тескери транскриптаза аркылуу алардын толуктоочу ДНК ырааттуулугуна айланышы керек, андан кийин жаңы синтезделген ДНКны RT-PCR деп аталган стандарттуу ПТР процедуралары менен күчөтүүгө болот.
RT-PCR процесси
РНК экстракциясы
Бул ыкманы аткаруу үчүн, негизинен, вирустук РНК казылып алынышы керек.Ыңгайлуу, тез жана эффективдүү бөлүү үчүн РНКны тазалоочу ар кандай комплекттерди колдонсо болот.
Коммерциялык комплект аркылуу вирустук РНКны бөлүп алуу үчүн алгач үлгүнү микроцентрифуга түтүгүнө кошуп, андан кийин аны лизис буфери менен аралаштырыңыз.Бул буфер өтө денатурацияланган жана көбүнчө фенол менен гуанидин изоцианаттан турат.Мындан тышкары, RNase ингибиторлору бузулбаган вирустук РНКнын изоляциясын камсыз кылуу үчүн, адатта, лизис буферинде болот.
Лизис буферин кошкондон кийин аралаштыргыч түтүктү импульс менен айлантып, бөлмө температурасында инкубациялаңыз.Андан кийин вирус лизис буфери тарабынан камсыз кылынган жогорку денатурацияланган шарттарда лизденет.
Үлгү лизиден кийин тазалоо процедурасы үчүн центрифуга түтүгү колдонулат.Үлгү центрифуга түтүгүнө жүктөлөт, андан кийин центрифугаланат.
Бул процедура стационардык фаза силикагель матрицасынан турган катуу фазалык экстракция ыкмасы.
Оптималдуу туз жана рН шарттарында РНК молекулалары кремний диоксиди мембранасы менен байланышат.
Ошол эле учурда белок жана башка булгоочу заттар алынып салынат.
Центрифугадан кийин центрифуга түтүгүн таза чогултуучу түтүккө салып, фильтратты ыргытып, анан жуугуч буферди кошуңуз.
Жуу буферин мембранадан өткөрүү үчүн түтүктү кайрадан центрифугага салыңыз.Бул силикагель менен байланышкан РНКны гана калтырып, мембранадан калган бардык кирлерди жок кылат.
Үлгү жуулгандан кийин, түтүктү таза микроцентрифуга түтүгүнө салып, элюциялык буферди кошуңуз.
Андан кийин ал центрифугадан өткөрүлөт, ал элюциялык буферди мембрана аркылуу күчтөп өткөрөт.Элюция буфери спиндик колонкадан вирустук РНКны жок кылат жана протеиндер, ингибиторлор жана башка булгоочу заттардан тазаланган РНКны алат.
Аралаш концентрат
Вирустук РНКны бөлүп алгандан кийин, кийинки кадам ПТР күчөтүү үчүн реакция аралашмасын даярдоо болуп саналат.Бул этапта концентрат колдонулат.Бул концентрацияланган эритме алдын ала аралаштырылган концентрацияланган эритме болуп саналат, премикстен, тескери транскриптазадан, нуклеотиддерден, алдыга праймерден, тескери праймерден, TaqMan зондунан жана ДНК полимеразадан турат.
Акырында, бул реакция аралашмасын аяктоо үчүн РНК шаблону кошулат.Түтүктөр импульстук вортекс менен аралаштырылат, андан кийин реакция аралашмасы ПТР пластинкасына жүктөлөт.ПЦР плитасы адатта 96 скважинаны камтыйт жана бир эле учурда бир нече үлгүлөрдү талдай алат.
ПЦР күчөтүү
Андан кийин, пластинканы ПЦР машинасына салыңыз, ал негизинен жылуулук цикли болуп саналат.
Реалдуу убакыт режиминдеги RT-PCR RdrRP гениндеги, E гениндеги жана N гениндеги максаттуу ырааттуулукту күчөтүү аркылуу 2019-жылдагы жаңы коронавирусту аныктоо үчүн колдонулат.Максаттуу генди тандоо праймерге жана зонддун ырааттуулугуна жараша болот.
RT-PCRдин биринчи кадамы тескери транскрипция болуп саналат.Комплементарлык ДНКнын биринчи тилкеси синтезделет, ал вирустун РНК геномунун комплементарлык бөлүгү менен байланышуучу ПТР тескери праймери тарабынан башталат.Андан кийин тескери транскриптаза вирустук РНКга комплементарлык ДНКны синтездөө үчүн праймердин 3′ учуна ДНК нуклеотиддерин кошот.Бул кадамдын температурасы жана узактыгы колдонулган праймерлер, максаттуу РНК жана тескери транскриптазадан көз каранды.
Андан кийин, РНК-ДНК гибридинин денатурациясына алып келген баштапкы денатурация кадамы колдонулат.Бул кадам ДНК полимеразаны активдештирүү үчүн зарыл.Ошол эле учурда тескери транскриптаза инактивацияланат.
ПЦР бир катар жылуулук циклдеринен турат.Ар бир цикл денатурация, күйдүрүү жана узартуу баскычтарынан турат.
Денатурация кадамы реакция камерасын 95 градус Цельсийге чейин ысытууну жана аны кош тилкелүү ДНК шаблонунун денатурациясы үчүн колдонууну камтыйт.
Кийинки кадамда реакциянын температурасы 58 градус Цельсийге чейин төмөндөтүлүп, алдыдагы праймер өзүнүн бир катарлуу ДНК шаблонунун толуктоочу бөлүгүнө кошулууга мүмкүндүк берет.Күйүү температурасы праймердин узундугуна жана курамына түздөн-түз көз каранды.
Кеңейтүү кадамында ДНК полимеразасы ДНК шаблон тизмегине кошумча болгон жаңы ДНК тилкесин синтездейт.Реакция аралашмасынан 5′-3′багыттагы шаблонго кошумча эркин ядролорду кошуу менен.Бул кадамдын температурасы колдонулган ДНК полимеразага жараша болот.
Биринчи айлампадан кийин, эки тилкелүү ДНК бутасы алынат.
Андан кийин, экинчи циклге кириңиз.Кош тизмектүү ДНК денатурацияланып, эки бир тилкелүү ДНК молекуласын пайда кылат.
Кийинки кадамда реакциянын температурасы төмөндөтүлөт, праймерлер ар бир бир саптуу ДНК шаблонуна, ал эми Taq-man зонду максаттуу ДНКнын толуктоочу бөлүгүнө күйдүрүлөт.
TaqMan зонду олигонуклеотиддик зонддун 5′ учу менен коваленттүү байланышкан флюорофордон турат.Циклдин жарык булагы менен дүүлүккөндө флюорофор флуоресценцияны чыгарат.Мындан тышкары, зонд 3′ аягындагы өчүргүчтөн турат.Кабарчы гендин өчүргүчкө жакындыгы флуоресценцияны аныктоого тоскоол болот.
Узартуу кадамында ДНК полимераза жаңы жипти синтездейт.Полимераз TaqMan зондуна жеткенде, анын эндогендик 5′нуклеаздык активдүүлүгү боёкту өчүргүчтөн бөлүп, зондду ажыратат.
ПТРдин ар бир цикли менен боёктордун көбүрөөк молекулалары бөлүнүп чыгат, натыйжада синтезделген ампликондордун санына пропорционалдуу флуоресценция интенсивдүүлүгү көбөйөт.
Бул ыкма үлгүдөгү берилген ырааттуулуктун санын баалоого мүмкүндүк берет.Кош тизмектүү ДНК фрагменттеринин саны ар бир циклде эки эсе көбөйөт.Ошондуктан, ПЦР өтө кичинекей үлгүлөрдү талдоо үчүн колдонулушу мүмкүн.
Флуоресценттик сигналды өлчөө үчүн, вольфрам галоген лампа, дүүлүктүрүүчү чыпка, рефлектор, линза, эмиссия чыпкасы жана заряддуу туташкан түзүлүштө колдонулган CCD камера.
4-КАДАМ аныктоо
Флуоресценттик сигналды өлчөө үчүн, вольфрам галоген лампа, дүүлүктүрүүчү чыпка, рефлектор, линза, эмиссия чыпкасы жана заряддуу туташкан түзүлүштө колдонулган CCD камера.
Лампанын чыпкаланган нуру рефлектор аркылуу чагылып, конденсатордук линзадан өтүп, ар бир тешиктин борборуна багытталган.Андан кийин тешиктен чыккан флуоресценция күзгүдөн чагылып, эмиссия фильтринен өтүп, CCD камерасы аркылуу аныкталат.Ар бир ПТР циклинде өзүн-өзү козгогон флюорофор жарыкты ПЗС аныктоого болот.
Ал тартылган жарыкты санариптик маалыматка айлантат.Бул ыкма реалдуу убакыт ПТР деп аталат жана ал ПТР реакциясынын жүрүшүнө реалдуу убакыт режиминде мониторинг жүргүзүүгө мүмкүндүк берет.
Посттун убактысы: 19-июль-2021