• facebook
  • linkedin
  • youtube

Лабораторияда жаңы болгондуктан, конверсия ылдамдыгы төмөн өсүмдүктөрдүн бир тутамынан оң өсүмдүктөрдү бөлүп алуу жакшы иш эмес.Биринчиден, ДНК көп сандагы үлгүлөрдөн бир-бирден алынышы керек, андан кийин бөтөн гендер ПЦР аркылуу аныкталат.Бирок, натыйжалар көбүнчө боштуктар жана кээде бир нече элементтерден турган тилкелер болуп саналат, бирок өткөрүп жиберилген аныктоолор же жалган аныктоолор бар-жогун аныктоо мүмкүн эмес..Мындай эксперименталдык процесске жана натыйжаларга туш болуу өтө алсызбы?Кабатыр болбоңуз, бир тууган сизге трансгендик позитивдүү өсүмдүктөрдү кантип оңой жана так аныктоону үйрөтөт.

1 кадам

Дизайн аныктоо праймерлери

Rapid1

Текшере турган үлгүгө ылайык аныктала турган эндогендик генди жана экзогендик генди аныктаңыз жана праймерди долбоорлоо үчүн гендин өкүлү 100-500bp ырааттуулугун тандаңыз.Жакшы праймерлер аныктоо натыйжаларынын тактыгын камсыздай алат жана аныктоо убактысын кыскарта алат (кеңири колдонулган аныктоо праймерлери үчүн тиркемени караңыз).

Эскертүү: Жаңы иштелип чыккан праймерлер реакция шарттарын оптималдаштырып, масштабдуу аныктоодон мурун аныктоонун тактыгын, тактыгын жана аныктоо чегин текшериши керек.

2-кадам

Эксперименттик протоколду долбоорлоо

Rapid2

Позитивдүү башкаруу: ПЦР реакция системасы жана шарттары нормалдуу экендигин аныктоо үчүн шаблон катары максаттуу фрагментти камтыган тазаланган ДНКны колдонуңуз.

Терс/бош контролдук: ПТР системасында булгануунун булагы бар же жок экенин аныктоо үчүн калып катары максаттуу фрагменти камтыбаган ДНК шаблонун же ddH2O колдонуңуз.

Ички маалымдама контролу: шаблондун ПТР аркылуу аныкталышы мүмкүн экендигине баа берүү үчүн сыналган үлгүнүн эндогендик генинин праймер/зонд айкалышын колдонуңуз.

Эскертүү:

Эксперименттик натыйжалардын негиздүүлүгүн баалоо үчүн ар бир тестке оң, терс/бош контроль жана ички контролдук контроль коюлушу керек.

Эксперимент даярдоо

Rapid3

Колдонуудан мурун, эритме бир калыпта аралашканына көз салыңыз.Эгерде жаан-чачындар табылса, аны колдонуудан мурун көрсөтмөлөргө ылайык эритип, аралаштыруу керек.2×PCR аралашмасын пипеткалоо керек жана иондун бирдей эмес бөлүштүрүлүшүнө жол бербөө үчүн колдонуудан мурун микропипетка менен кайра-кайра аралаштыруу керек.

Эскертүү:

Колдонмосун алып чыгып, аны кунт коюп окуп чыгыңыз жана колдонмонун талаптарын так сактоо менен эксперимент алдында даярданыңыз.

4-кадам

ПЦР реакция системасын даярдоо

Rapid4

Эксперименттик протоколго ылайык, праймерлерди, H2O жана 2×PCR аралашмасын бирдей кылып аралаштырыңыз, центрифугалаңыз жана аларды ар бир реакция түтүкчөсүнө таратыңыз.

Эскертүү:

Кең масштабдуу же узак мөөнөттүү тестирлөө үчүн ПЦР продуктулары менен шартталган аэрозолдук булгануудан эффективдүү кача турган UNG ферментин камтыган ПЦР реакция системасын колдонуу сунушталат.

5-кадам

Реакция үлгүсүн кошуңуз

Rapid5

Түздөн-түз ПТР технологиясын колдонуу менен нуклеиндик кычкылды тазалоо процессин талап кылбайт, үлгү шаблону 10 мүнөттүн ичинде даярдалып, тиешелүү ПТР реакция системасын кошууга болот.

Эскертүү:

Бөлүү ыкмасы жакшыраак аныктоочу эффектке ээ жана алынган продукт бир нече аныктоо реакциялары үчүн колдонулушу мүмкүн.

Rapid6

5.1: жалбырактардын түз кеңейиши

Колдонмодогу сүрөттүн өлчөмүнө ылайык диаметри 2-3мм болгон жалбырак кыртышын кесип, ПЦР реакция системасына салыңыз.

Эскертүү: жалбырак фрагменттери ПЦР реакциясы эритмесинде толугу менен чөмүлдүрүлгөнүн текшериңиз жана ашыкча жалбырак кыртышын кошпоңуз.

5.2: Жалбырактарды бөлүү ыкмасы

Диаметри 5-7 мм болгон жалбырак кыртышын кесип, центрифугалык түтүккө салыңыз.Эгерде сиз жетилген жалбырактарды тандасаңыз, жалбырактын негизги тамырынын кыртыштарын колдонуудан алыс болуңуз.Пипетка 50ul Buffer P1 лизатын центрифугалык түтүккө салып, лизат жалбырактын кыртышын толугу менен батыра алсын, аны термикалык циклерге же металл ваннага салыңыз жана 95°C температурада 5-10 мүнөт лизист.

Rapid7

50ul Buffer P2 нейтралдаштыруу эритмесин кошуп, жакшылап аралаштырыңыз.Алынган лизат шаблон катары колдонулушу мүмкүн жана ПТР реакция системасына кошулат.

Эскертүү: Калыптын көлөмү ПТР системасынын 5-10% түзөт жана 20% ашпоого тийиш (мисалы, 20мкл ПТР системасына 1-2мкл лизис эритмеси, 4мклден көп эмес).

6-кадам

ПЦР реакциясы

Rapid8

ПЦР реакциясынын түтүгү центрифугалангандан кийин, ал күчөтүү үчүн ПТР аспабына салынат.

Эскертүү:

Реакция күчөтүү үчүн тазаланбаган шаблонду колдонот, ошондуктан күчөтүү циклдеринин саны тазаланган ДНК шаблонуна караганда 5-10 циклге көп.

7-кадам

Электрофорезди аныктоо жана натыйжаларды талдоо

Rapid9

M: 100bp DNA Ladder

1\4: Тазаланган ДНК ыкмасы

2\5: Түздөн-түз ПТР ыкмасы

3\6: Бош башкаруу

QC:

Экспериментте коюлган ар кандай башкаруу элементтеринин сыноо натыйжалары төмөнкү шарттарга жооп бериши керек.Болбосо, көйгөйдүн себебин анализдеп, көйгөй жоюлгандан кийин кайра текшерүү керек.

Таблица 1. Ар кандай контролдук топтордун нормалдуу тестирлөө жыйынтыктары

* Плазмид оң башкаруу катары колдонулганда, эндогендик ген тестинин натыйжасы терс болушу мүмкүн

Жыйынтык чечим:

A. Үлгүнүн эндогендик генинин тестинин натыйжасы терс болуп саналат, бул кадимки ПТР аныктоого ылайыктуу ДНКны үлгүдөн бөлүп алуу мүмкүн эместигин же алынган ДНКда ПТР реакциясынын ингибиторлору бар экенин жана ДНКны кайра экстракциялоо керектигин көрсөтөт.

B. Үлгүнүн эндогендик генинин тестинин натыйжасы оң, ал эми экзогендик гендин тестинин натыйжасы терс болуп саналат, бул үлгүдөн кадимки ПТР аныктоого ылайыктуу ДНК алынганын көрсөтүп турат жана үлгүдө XXX гени аныкталган эмес деп айтууга болот.

C. Үлгүнүн эндогендик генинин тестинин натыйжасы оң, ал эми экзогендик гендин тестинин натыйжасы оң, бул үлгүдөн кадимки ПТР аныктоого ылайыктуу ДНК алынгандыгын жана үлгү ДНКсы ХХХ генин камтыйт.Ырастоочу эксперименттер дагы жүргүзүлүшү мүмкүн.

8-кадам

Дизайн аныктоо праймерлери

Rapid10

Эксперименттен кийин айлана-чөйрөнүн булганышын алдын алуу үчүн эксперименттик аянтты сүртүү үчүн 2% натрий гипохлорит эритмеси жана 70% этанол эритмеси колдонулат.


Посттун убактысы: 2021-жылдын 8-сентябрына чейин