Обзор
Трансгендик өсүмдүктөрдү тез идентификациялоо
Текст/Тонг Ючэнг
Эксперименталдык операция/Хан Ин
Редактор/Вэн Южун
Сөздөр/1600+
Сунушталган окуу убактысы/8-10 мүнөт
Трансгендик өсүмдүктөрдү тез идентификациялоо
Лабораторияга жаңы келген адам катары, конверсиялык көрсөткүчү төмөн өсүмдүктөрдүн бир тутамынан оң өсүмдүктөрдү бөлүп алуу жакшы иш эмес.Биринчиден, ДНК көп сандагы үлгүлөрдөн бир-бирден алынышы керек, андан кийин бөтөн гендер ПЦР аркылуу аныкталат.Бирок, натыйжалар көбүнчө боштуктар жана кээде бир нече элементтерден турган тилкелер болуп саналат, бирок өткөрүп жиберилген аныктоолор же жалган аныктоолор бар-жогун аныктоо мүмкүн эмес..Мындай эксперименталдык процесске жана натыйжаларга туш болуу өтө алсызбы?Кабатыр болбоңуз, бир тууган сизге трансгендик позитивдүү өсүмдүктөрдү кантип оңой жана так аныктоону үйрөтөт.
1 кадам: Дизайн аныктоо праймерлери
Текшере турган үлгүгө ылайык аныктала турган эндогендик генди жана экзогендик генди аныктаңыз жана праймерди долбоорлоо үчүн гендин өкүлү 100-500bp ырааттуулугун тандаңыз.Жакшы праймерлер аныктоо натыйжаларынын тактыгын камсыздай алат жана аныктоо убактысын кыскарта алат (кеңири колдонулган аныктоо праймерлери үчүн тиркемени караңыз).
Эскертүү:
Жаңы иштелип чыккан праймерлер реакция шарттарын оптималдаштырып, масштабдуу аныктоону жүргүзүүдөн мурун аныктоонун тактыгын, тактыгын жана аныктоо чегин текшериши керек.
2-кадам:Эксперименттик протоколду иштеп чыгуу
Позитивдүү башкаруу: ПЦР реакция системасы жана шарттары нормалдуу экендигин аныктоо үчүн шаблон катары максаттуу фрагментти камтыган тазаланган ДНКны колдонуңуз.
Терс/бош башкаруу: ДНК үлгүсүн же ddH колдонуңуз2ПЦР системасында булгануунун булагы бар же жок экенин аныктоо үчүн шаблон катары максаттуу фрагментти камтыбаган O.
Ички маалымдама контролу: шаблондун ПТР аркылуу аныкталышы мүмкүн экендигине баа берүү үчүн сыналган үлгүнүн эндогендик генинин праймер/зонд айкалышын колдонуңуз.
Эскертүү:
Эксперименттик натыйжалардын негиздүүлүгүн баалоо үчүн ар бир тестке оң, терс/бош контроль жана ички контролдук контроль коюлушу керек.
3-кадам: Эксперимент даярдоо
Колдонуудан мурун, эритме бир калыпта аралашканына көз салыңыз.Эгерде жаан-чачындар табылса, аны колдонуудан мурун көрсөтмөлөргө ылайык эритип, аралаштыруу керек.2×PCR аралашмасын пипеткалоо керек жана иондун бирдей эмес бөлүштүрүлүшүнө жол бербөө үчүн колдонуудан мурун микропипетка менен кайра-кайра аралаштыруу керек.
Эскертүү:
Көрсөтмөлөрдү алып чыгып, кылдаттык менен окуп чыгыңыз жана көрсөтмөлөргө так ылайык экспериментке чейин даярданыңыз.
4-кадам: ПТР реакция системасын даярдоо
Эксперименттик протоколго ылайык, праймерлерди аралаштырыңыз, H2O, 2×PCR аралаштыруу, центрифугалоо жана аларды ар бир реакция түтүкчөсүнө бөлүштүрүү.
Эскертүү:
Кең масштабдуу же узак мөөнөттүү тестирлөө үчүн ПЦР продуктулары менен шартталган аэрозолдук булгануудан эффективдүү кача турган UNG ферментин камтыган ПЦР реакция системасын колдонуу сунушталат.
5-кадам: Реакция үлгүсүн кошуңуз
Түздөн-түз ПТР технологиясын колдонуу менен нуклеиндик кислотаны тазалоо процессинин тажатма кереги жок.Үлгү шаблону 10 мүнөттүн ичинде даярдалып, тиешелүү ПТР реакция системасына кошулушу мүмкүн.
Эскертүү:
Лизис ыкмасы жакшыраак аныктоо эффектине ээ жана алынган продукт бир нече аныктоо реакциялары үчүн колдонулушу мүмкүн.
5.1: Жалбырактардын түз ПТР
Колдонмодогу сүрөттүн өлчөмүнө ылайык диаметри 2-3мм болгон жалбырак кыртышын кесип, ПЦР реакция системасына салыңыз.
Эскертүү: жалбырак фрагменттери ПЦР реакциясы эритмесинде толугу менен чөмүлдүрүлгөнүн текшериңиз жана ашыкча жалбырак кыртышын кошпоңуз.
5.2: Жалбырактарды лизис ыкмасы
Диаметри 5-7 мм болгон жалбырак кыртышын кесип, центрифугалык түтүккө салыңыз.Эгерде сиз жетилген жалбырактарды тандасаңыз, жалбырактын негизги тамырынын кыртыштарын колдонуудан алыс болуңуз.Пипетка 50ul Buffer P1 лизатын центрифугалык түтүккө салып, лизат жалбырактын кыртышын толугу менен батыра алсын, аны термикалык циклерге же металл ваннага салыңыз жана 95°C температурада 5-10 мүнөт лизист.
50ul Buffer P2 нейтралдаштыруу эритмесин кошуп, жакшылап аралаштырыңыз.Алынган лизат шаблон катары колдонулушу мүмкүн жана ПТР реакция системасына кошулат.
Эскертүү: Калыптын көлөмү ПТР системасынын 5-10% ортосунда болушу керек жана 20% ашпоого тийиш (мисалы, 20мкл ПТР системасында 1-2мкл лизис буферин кошуңуз, 4мклден көп эмес).
6-кадам: ПТР реакциясы
ПЦР реакция түтүгүн центрифугалагандан кийин, аларды күчөтүү үчүн ПТР аспабына салыңыз.
Эскертүү:
Реакция күчөтүү үчүн тазаланбаган шаблонду колдонот, ошондуктан күчөтүү циклдеринин саны тазаланган ДНК шаблонуна караганда 5-10 циклге көп.
7-кадам: Электрофорезди аныктоо жана натыйжаларды талдоо
M:100bp DNA Ladder
1\4: Тазаланган ДНК ыкмасы
2\5: Түздөн-түз ПТР ыкмасы
3\6: Бош башкаруу
Сапатты көзөмөлдөө:
Экспериментте коюлган ар кандай башкаруу элементтеринин сыноо натыйжалары төмөнкү шарттарга жооп бериши керек.Болбосо, көйгөйдүн себебин анализдеп, көйгөй жоюлгандан кийин кайра текшерүү керек.
Таблица 1. Ар кандай контролдук топтордун нормалдуу тестирлөө жыйынтыктары
* Плазмид оң башкаруу катары колдонулганда, эндогендик ген тестинин натыйжасы терс болушу мүмкүн
Жыйынтык чечим:
A. Үлгүнүн эндогендик генинин тестинин натыйжасы терс болуп саналат, бул кадимки ПТР аныктоого ылайыктуу ДНКны үлгүдөн бөлүп алуу мүмкүн эместигин же алынган ДНКда ПТР реакциясынын ингибиторлору бар экенин жана ДНКны кайра экстракциялоо керектигин көрсөтөт.
B. Үлгүнүн эндогендик генинин тестинин натыйжасы оң, ал эми экзогендик гендин тестинин натыйжасы терс болуп саналат, бул үлгүдөн кадимки ПТР аныктоого ылайыктуу ДНК алынгандыгын көрсөтүп турат жана үлгүдө XXX гени аныкталган эмес деп айтууга болот.
C. Үлгүнүн эндогендик генинин сыноо натыйжасы оң, ал эми экзогендик гендин сыноо жыйынтыгы оң, бул үлгүдөн кадимки ПТР аныктоого ылайыктуу ДНК алынгандыгын жана үлгү ДНКсы ХХХ генин камтыйт.Ырастоочу эксперименттер дагы жүргүзүлүшү мүмкүн.
8-кадам: аныктоо праймерлерин долбоорлоо
Эксперименттен кийин айлана-чөйрөнүн булганышын алдын алуу үчүн эксперименттик аянтты сүртүү үчүн 2% натрий гипохлорит эритмеси жана 70% этанол эритмеси колдонулат.
Тиркеме
Таблица 2. Генетикалык модификацияланган өсүмдүктөрдү жалпы ПТР аныктоо үчүн кеңири колдонулган праймерлер
Маалымдама документ:
SN/T 1202-2010, Тамак-аштагы генетикалык жактан өзгөртүлгөн өсүмдүк ингредиенттерин сапаттуу ПТР аныктоо ыкмасы.
Айыл чарба министрлигинин жарыясы 1485-5-2010, Генетикалык жактан өзгөртүлгөн өсүмдүктөрдүн жана алардын продуктуларынын ингредиенттерин сыноо - күрүч M12 жана анын туундулары.
Посттун убактысы: 09-июнь-2021
