• facebook
  • linkedin
  • youtube

Салттуу тескери транскриптазалар жогорку температурага чыдай албайт (MMLV активдүүлүгү үчүн оптималдуу температура 37-50°С, ал эми AMV 42-60°С).Татаалыраак вирустук РНКны төмөнкү температурада кДНКга эффективдүү тескери транскрипциялоо мүмкүн эмес, натыйжада аныктоонун натыйжалуулугу төмөндөйт.Салттуу RT-qPCR жалпысынан эки негизги ферменттин (кайтарым транскриптаза жана ДНК полимераза) катышуусун талап кылат, бул реакция системасынын ишин жөнөкөйлөштүрүү жана баасын төмөндөтүү мүмкүн эмес.Бул жерде биз жогорку температурага туруктуу эки тескери транскриптазаны, TtH жана RevTaq киргизебиз.Бул эки ферменттин да ДНК-полимераза функциясы бар, ошондуктан алар эки функционалдуу ферменттер деп аталат.

TtH ДНК полимераза

Сиз Thermus thermophilus HB8 термофилдүү бактериясынан алынган TtH жөнүндө уккан болушуңуз керек.Mg2+ сыяктуу эки валенттүү катиондордун катышуусунда ДНК полимераза активдүүлүгүнө ээ.Ал Taq ферменти сыяктуу ПТР реакцияларында кеңири колдонулат, бирок Taq ферментине караганда жылуулукка туруктуулугу жогору, ошондуктан ал GC мазмуну жогорку шаблондор менен ПТРге жакшыраак таасир этет.

· Бул фермент негизинен 3′→5′ экзонуклеаза активдүүлүгүнө жана 5′→3′ экзонуклеаза активдүүлүгүнө ээ, ошондуктан аны дидеокси секвенирлөө үчүн да колдонсо болот.

· Бул фермент RTase активдүүлүгүнө ээ.Mn2+ болгон учурда RTase активдүүлүгү жогорулайт.Бул функцияны колдонуу менен, аны бир эле түтүктө тескери транскрипция реакциясын жана ПТР реакциясын аткаруу үчүн колдонсо болот, башкача айтканда, бир кадамдуу RT-PCR.Бирок Mn2+ болгон учурда RT-ПЦРдин тактыгы жогору эмес.RT активдүүлүгүнүн rnaase H активдүүлүгү менен эч кандай байланышы жок.

· Tth-ДНК полимеразанын активдүүлүгүнүн жогорулашы (pH9, оптималдуу +55℃~+70℃, максимум +95℃) РНКнын экинчилик структурасынан келип чыккан көйгөйлөрдү жеңет.Алынган кДНКны Mg2+ иондорунун катышуусунда ошол эле фермент менен ПТР менен күчөтүүгө болот.

· Tth-ДНК полимеразанын жогорку температурада тескери транскрипцияны жана ДНКны күчөтүү жөндөмдүүлүгү бул энзимди сандык RT-PCR, клондоштуруу жана клеткалык жана вирустук РНКнын ген экспрессиясын талдоо үчүн пайдалуу кылат.
· Tth-ДНК полимераза RT-PCR үчүн РНКны 1кб чейин күчөтүү үчүн колдонулат.

нөл
 

Өзгөчөлүктөрү жана артыкчылыктары

Tth ДНК полимераза:

• оптималдаштырылган полимераздык чынжыр реакциясынын (ПТР) продуктунун өлчөмүн, RT-PCR реакциясында кеминде 1000 bp камсыз кылуу

• Модификацияланган дезоксирибонуклеозид трифосфатты субстрат катары кабыл алыңыз

• RNase H активдүүлүгүнө байланыштуу эмес

• Адатта РНКдагы жогорку экинчи структурага байланыштуу көйгөйлөрдү чечүү үчүн жогорку жылуулук туруктуулугуна ээ

RevTaq RT-ПЦР ДНК полимераза

Тескери транскриптаза активдүүлүгү менен ысыкка чыдамдуу ДНК полимераза

RevTaq-RT-PCR-ДНК-полимераза инженердик, жогорку ысыкка чыдамдуу, эки функционалдуу фермент, тескери транскриптаза жана ДНК полимераза активдүүлүгү багытталган жана жасалма эволюция аркылуу алынган.

· RevTaq RT-PCR ДНК полимеразасынын жарым ажыроо мезгили 95°C 40 мүнөттөн ашат.

· RevTaq RT-PCR ДНК полимеразасы РНК шаблонунан түздөн-түз жогорку температурадагы тескери транскрипцияга мүмкүндүк берет жана тескери транскрипция кадамы кДНКнын көбүрөөк калыптарын түзүү үчүн бир нече жолу кайталанышы мүмкүн.

· RevTaq RT-PCR ДНК полимеразасы "нөл кадам" RT-PCR (изотермикалык тескери транскрипция кадамы жок) мүмкүндүк берет, анткени циклдик ПТР узартуу кадамында тескери транскрипция жана ДНКнын күчөшү бир убакта ишке ашат.Бул ошондой эле жогорку температурада тескери транскрипция реакциясына өбөлгө түзөт, ошону менен РНКдагы күчтүү экинчи структураны жогорку температурада эритүү учурундагы көйгөйлөрдү азайтат.

· Аптамерге негизделген ысык баштоо формуласынын аркасында RevTaq RT-PCR ДНК полимеразасы күйгүзүү жана узартуу температурасы 57°C жогору болгондо жакшы натыйжаларды берет.

· Фермент ысыкка чыдамдуу болгондуктан, өтө жогору эрүү чекиттери (>60°C) болгон праймерлерди жана зонддорду долбоорлоо сунушталат.

· Реакцияны орнотуу процессинде температура градиенти аркылуу күйдүрүү/узартуу баскычынын температурасын оптималдаштыруу сунушталат.

· Температура канчалык жогору болсо, ПЦРдин өзгөчөлүгү ошончолук жогору болот.Тескери транскрипция цикли адатта ПТР циклине караганда жогорку температурада аткарылат, анткени ДНК Primer:RNA Template гибриддештирүү адатта ДНК Primer:cDNA Template дуплексине караганда жогору эрүү температурасына ээ.

· RevTaq RT-PCR ДНК полимеразасы гендик инженерияланган жана оптималдаштырылган жана ампликондун өлчөмү 60-300 bp ортосунда.

RevTaq RT-PCR ДНК полимеразаны аныктоо чеги 4 нускага жетет/Эки (2)

Оптимизацияланган реакция системасы (жогорку эрүү чекитиндеги праймерлерди түзүү) сүрөттө көрсөтүлгөн.RevTaq RT-PCR ДНК полимераза менен башкарылган RT-PCR TaqPath 1-кадам RT-qPCR мастер аралашмасына караганда жакшыраак сезгичтикти жана төмөнкү аныктоочу Үлгү суюлтуу градиентин көрсөтөт.

Көбүрөөк артыкчылыктар:

Ыкчам баштоо функциясы → Алгачкы термикалык денатурация кадамын өткөрүп жиберүүгө болот.

Hot-start aptamer формуласы → 100% ферменттин активдүүлүгүн дароо камсыз кылып, төмөнкү температурада (<57°C) спецификалык эмес күчөтүүнү алдын алыңыз.

Бөлүнүү функциясы → РНКны экстракциялоо кадамы өткөрүлбөйт, анткени RevTaq RT-PCR ДНК полимеразасы чийки реакция үлгүлөрүн да иштете алат.Ал эукариоттордун, бактериялардын жана вирустардын клетка мембраналарын ысык RT-PCR циклинде дароо жок кыла алат.

IVD чийки зат деңгээл → жогорку сапат стандарттары жана өтө атаандаштыкка жөндөмдүү баалар


Посттун убактысы: 12-август-2021