Баштапкы материал: РНК
Сандык тескери транскрипциялуу ПТР (RT-qPCR) – баштапкы материал катары РНКны колдонуу менен ПТР эксперименттеринде колдонулган эксперименталдык ыкма.Бул ыкмада жалпы РНК же кабарчы РНК (мРНК) алгач тескери транскриптаза аркылуу комплементарлык ДНКга (cDNA) транскрипцияланат.Андан кийин, cDNAны калып катары колдонуу менен qPCR реакциясы аткарылды.RT-qPCR ар кандай молекулярдык биология колдонмолорунда, анын ичинде ген экспрессиясын анализдөөдө, РНК интерференциясын текшерүүдө, микроаррейлерди текшерүүдө, патогенди аныктоодо, генетикалык тестирлөөдө жана ооруну изилдөөдө колдонулат.
RT-qPCR үчүн бир кадамдуу жана эки кадамдуу методдор
RT-qPCR бир кадам же эки кадам ыкмасы менен ишке ашырылышы мүмкүн.Бир кадамдуу RT-qPCR тескери транскрипцияны жана ПТР күчөтүүнү айкалыштырат, бул тескери транскриптазага жана ДНК полимеразага бирдей буфердик шарттарда бир түтүктө реакцияны аяктоого мүмкүндүк берет.Бир кадамдуу RT-qPCR ырааттуулугу үчүн атайын праймерлерди колдонууну гана талап кылат.Эки кадамдуу RT-qPCRде тескери транскрипция жана ПТР күчөтүү эки түтүктө, ар кандай оптималдаштырылган буферлерди, реакция шарттарын жана праймерди долбоорлоо стратегияларын колдонуу менен жүргүзүлөт.
| Артыкчылык | Кемчилик | |
| Бир кадам | Бул ыкманын эксперименттик катасы азыраак, анткени эки реакция тең бир түтүктө жүргүзүлөт
Питингдердин азыраак кадамдары булгануу коркунучун азайтат
Жогорку өндүрүмдүүлүктү күчөтүү/скрининг үчүн ылайыктуу, тез жана кайталануучу | Эки баскычтуу реакцияларды өзүнчө оптималдаштыруу мүмкүн эмес
Реакция шарттары эки баскычтуу реакцияны айкалыштыруу менен бузулгандыктан, сезгичтик эки баскычтуу ыкмадагыдай жакшы эмес.
Бир эле үлгү менен аныкталган максаттардын саны аз |
| Эки кадам | Узак мөөнөткө сактала турган жана бир нече реакцияларда колдонула турган туруктуу cDNA китепканаларын түзүү мүмкүнчүлүгү
Максаттуу гендер жана маалымдама гендер бир кДНК китепканасынан бир нече кДНК китепканаларын талап кылбастан күчөтүлүшү мүмкүн
Реакция буферлери жана бир реакциянын жүрүшүн оптималдаштырууга мүмкүндүк берүүчү реакция шарттары
Триггер шарттарын ийкемдүү тандоо | Бир нече түтүктөрдү колдонуу жана пиптингдин көбүрөөк кадамдары ДНКнын булгануу коркунучун жогорулатат, жана убакытты талап кылат.
Бир кадамдык ыкмага караганда көбүрөөк оптималдаштырууну талап кылат |
Тектеш продуктылар:
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Бир кадам)-SYBR Green I
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Бир кадам)-Такман
RT Easyᵀᴹ Биринчи Страндын CDNA синтези үчүн Master Premix
Real Time PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Жалпы РНКны жана мРНКны тандоо
RT-qPCR экспериментин иштеп чыгууда, тескери транскрипция үчүн шаблон катары жалпы РНКны же тазаланган mRNAны колдонууну чечиш керек.mRNA бир аз жогору сезгичтикти камсыз кыла алат да, жалпы РНК дагы эле көп колдонулат.Мунун себеби, жалпы РНКнын мРНКга караганда баштапкы материал катары маанилүү бир артыкчылыгы бар.Биринчиден, процесс азыраак тазалоо кадамдарын талап кылат, бул шаблондун жакшыраак сандык калыбына келишин жана натыйжалардын баштапкы клетка номерлерине жакшыраак нормалдашуусун камсыз кылат.Экинчиден, мРНКны байытуу кадамынан качат, ал ар кандай mRNAлардын ар кандай калыбына келтирилишинен улам бурмаланган натыйжаларды алуу мүмкүнчүлүгүн болтурбайт.Жалпысынан, көпчүлүк колдонмолордо максаттуу гендин салыштырмалуу сандык көрсөткүчү аныктоонун абсолюттук сезгичтигинен маанилүүрөөк болгондуктан, жалпы РНК көпчүлүк учурларда ылайыктуу.
Тескери транскрипция праймери
Эки кадамдуу методдо кДНК реакциясын праймерлөө үчүн үч түрдүү ыкманы колдонсо болот: олиго(dT) праймерлер, туш келди праймерлер же ырааттуулукка тиешелүү праймерлер.Эреже катары, олиго(dT) праймерлер жана кокус праймерлер айкалышта колдонулат.Бул праймерлер шаблондун mRNA тилкесине кошулат жана синтез үчүн баштапкы чекит менен тескери транскриптазаны камсыз кылат.
| Праймер тандоо | Структура жана функция | Артыкчылык | Кемчилик |
| Oligo(dT) праймер (же анкерленген олиго(dT) праймер) | мРНКнын поли(А) куйругундагы тимин калдыктарына кеңейтилген күйүү;анкердик олиго(dT) праймеринин 3′ учунда G, C же А бар (казык жери) | Поли(А) куйруктуу мРНКдан толук узундуктагы кДНКнын синтези
Баштапкы материал азыраак болгондо колдонулат
Анкердик сайт олиго(dT) праймеринин мРНКнын 5′ поли(А) куйругу менен байланышын камсыздайт. | Поли(А) куйруктары бар гендерди күчөтүү үчүн гана ылайыктуу
Поли(А)дагы даярдоочу жайдан*2 кесилген кДНКны алыңыз
3′ учуна байланган *
*Эгер анкердик олиго(dT) праймерлери колдонулса, бул мүмкүнчүлүк минималдаштылат |
| туш келди праймер
| Узундугу 6дан 9га чейинки негиздер, РНК транскрипциясы учурунда бир нече сайттарга кошула алат | Бардык РНКларга (tRNA, rRNA жана mRNA) кошулуу
Маанилүү экинчи структурасы бар стенограммалар үчүн же баштапкы материал азыраак болгондо ылайыктуу
Жогорку cDNA кирешелүүлүгү | cDNA бардык РНКдан тескери транскрипцияланат, ал адатта каалабайт жана максаттуу мРНКнын сигналын суюлтушу мүмкүн
кесилген cDNA алуу |
| ырааттуулугу үчүн атайын праймерлер | Белгилүү mRNA ырааттуулугун багытталган жеке праймерлер | атайын cDNA китепканасы
сезгичтикти жакшыртуу
Тескери qPCR праймерлерин колдонуу | Бир максаттуу гендин синтези менен гана чектелет |
Тескери транскриптаза
Тескери транскриптаза – ДНКны синтездөө үчүн РНКны колдонгон фермент.Кээ бир тескери транскриптазалар RNase активдүүлүгүнө ээ жана транскрипциядан кийин РНК-ДНК гибриддик тилкелериндеги РНК тилкелерин начарлатышы мүмкүн.Эгерде ал RNase ферменттик активдүүлүгүнө ээ болбосо, RNaseH жогорку qPCR эффективдүүлүгү үчүн кошулса болот.Көбүнчө колдонулган ферменттерге Moloney чычкан лейкозунун вирусунун тескери транскриптазасы жана канаттуулардын миелобластома вирусунун тескери транскриптазасы кирет.RT-qPCR үчүн кДНК синтези жогорку температурада жүргүзүлүшү үчүн, жогорку экинчилик структурасы бар РНКлардын ийгиликтүү транскрипциясын камсыз кылуу, реакциянын бүткүл процессинде алардын толук активдүүлүгүн сактоо, натыйжада кДНКнын жогорку түшүмдүүлүгүн камсыз кылуу үчүн жогорку термостубилдүүлүк менен тескери транскриптазаны тандоо идеалдуу.
Тектеш продуктылар:
Болжолдуу M-MLV тескери транскриптаза
RNase H тескери транскриптаза активдүүлүгү
RNaseH РНК-ДНК дуплекстеринен РНК тилкелерин деградациялоого жөндөмдүү, бул кош тилкелүү ДНКнын эффективдүү синтезине мүмкүндүк берет.Бирок, узун мРНКны шаблон катары колдонгондо, РНК мөөнөтүнөн мурда бузулушу мүмкүн, натыйжада кДНК кесилген.Ошондуктан, көп учурда узак транскрипттердин синтези керек болсо, cDNA клондоштуруу учурунда RNaseH активдүүлүгүн азайтуу пайдалуу.Ал эми RNase H активдүүлүгү менен тескери транскриптазалар көбүнчө qPCR колдонмолору үчүн пайдалуу, анткени алар ПТРдин биринчи циклинде РНК-ДНК дуплекстеринин эрүү процессин күчөтөт.
Праймер дизайны
RT-qPCRдеги qPCR кадамы үчүн колдонулган ПТР праймерлери идеалдуу түрдө экзон-эксон кошулушун камтышы үчүн иштелип чыгышы керек, мында күчөтүүчү праймер иш жүзүндө экзон-интрон чек арасын камтышы мүмкүн.Интрон камтыган геномдук ДНК ырааттуулугу күчөтүлбөгөндүктөн, бул дизайн геномдук ДНКны булгануудан күчөтүлгөн жалган позитивдердин коркунучун азайтат.
Эгерде праймерлер экзондорду же экзон-эксон чек араларын бөлүү үчүн иштелип чыкпаса, геномдук ДНКнын булганышын жок кылуу үчүн РНК үлгүлөрүн RNase-эркин DNase I же dsDNase менен дарылоо зарыл болушу мүмкүн.
RT-qPCR башкаруу
ДНКнын булганышын (мисалы, геномдук ДНК же мурунку реакциялардын ПТР продуктулары сыяктуу) аныктоо үчүн бардык RT-qPCR эксперименттерине тескери транскрипциянын терс башкаруусу (-RT контролу) киргизилиши керек.Бул башкаруу тескери транскриптазадан башка бардык реакция компоненттерин камтыйт.Бул башкаруу менен тескери транскрипция болбогондуктан, ПТРдин күчөшү байкалса, ДНКдан булгануу мүмкүн.
Посттун убактысы: 02-02-2022
