Менин оюмча, аныктоо технологиясынын тарыхындагы бир нече революциялык ойлоп табуулар - антиген-антитело спецификалык байланыш, ПТР технологиясы жана секвенирлөө технологиясынын принцибине негизделген иммунолабелдөө технологиясы.Бүгүн биз ПЦР технологиясы жөнүндө сүйлөшөбүз.ПЦР технологиясынын эволюциясына ылайык, адамдар адатта ПТР технологиясын үч муунга бөлүшөт: кадимки ПТР технологиясы, реалдуу убакыттагы флуоресценттик сандык ПТР технологиясы жана санариптик ПТР технологиясы.
Common PCR техникасы
КАРЫ МУЛЛИС (1944.12.28-2019.8.7)
Кари Муллис 1983-жылы полимераздык чынжыр реакциясын (полимераздык чынжыр реакциясы, ПТР) ойлоп тапкан. Айтымдарында, ал сүйлөшкөн кызын айдап баратканда күтүүсүздөн илхам келип, ПЦР принциби (айдоонун пайдасы жөнүндө) жөнүндө ойлонгон.Кари Маллис 1993-жылы химия боюнча Нобель сыйлыгына татыктуу болгон. The New York Times мындай деп жазган: «Биологияны ПТРге чейинки жана ПТРдан кийинки доорлорго дээрлик экиге бөлгөн абдан оригиналдуу жана маанилүү.
ПЦР принциби: ДНК полимеразанын катализинде эне тилкеси ДНК шаблон катары колдонулат, ал эми спецификалык праймер кеңейтүүнүн баштапкы чекити катары колдонулат, ал эми ДНК эне тилкесинин шаблонуна толуктоочу кыз тилкеси ДНК денатурация, күйдүрүү, узартуу жана башка кадамдар аркылуу in vitro көчүрүлөт.Бул in vitro ДНК синтезин күчөтүү технологиясы, ал каалаган максаттуу ДНКны in vitro тез жана өзгөчө күчөтө алат.
Кадимки ПТРдин артыкчылыктары
1.Классикалык ыкма, толук эл аралык жана ата мекендик стандарттар
2.Аспаптын реагенттеринин төмөнкү баасы
3.ПЦР продуктуларын башка молекулярдык биология эксперименттери үчүн калыбына келтирүүгө болот
Сунушталган Foregene ПТР машинасы: https://www.foreivd.com/foreamp-sn-695-series-thermal-cycler-96-wells-pcr-machine-product/
Тектеш азыктар: https://www.foreivd.com/pcr-herotm-with-dye-product/
Кадимки ПТРдин кемчиликтери
1.булгоо оңой
2.оор операция
3.сапаттык талдоо гана
4.Орто сезгичтик
5.Спецификалык эмес күчөтүү бар жана спецификалык эмес тилке максаттуу тилке менен бирдей өлчөмдө болгондо, аны айырмалоо мүмкүн эмес.
Cапиллярдык электрофорезге негизделген ПТР
Кадимки ПТРдин кемчиликтерине жооп кылып, кээ бир өндүрүүчүлөр капиллярдык электрофорез принцибине негизделген приборлорду киргизишкен.Капиллярда ПЦР күчөтүлгөндөн кийин электрофорез кадамы аяктайт.сезгичтиги жогору, жана бир нече негиздердин айырмасын айырмалоого жана күчөтүү MAERKER тарабынан эсептелиши мүмкүн.продукт мазмуну.Кемчилиги - ПЦР продуктусун дагы эле ачып, аспапка салуу керек жана булгануу коркунучу дагы эле бар.
CапиллярдыкEэлектрофорез
2. Реалдуу убакыттагы флуоресценттик сандык ПТР (Quantitative Real-time PCR, qPCR) технологиясыФлуоресценттик сандык ПТР, ошондой эле анык убакыттагы ПТР деп да аталат, бул 1995-жылы PE (Перкин Элмер) тарабынан иштелип чыккан жаңы нуклеин кислотасынын сандык технологиясы. Флуоресценттик сандык ПТРдин өнүгүү тарыхы - ABI, Roche жана Bio-Rad сыяктуу гиганттардын жан-дүйнөсүн козгогон күрөшүнүн тарыхы.Эгер сизди кызыктырса, текшерип көрсөңүз болот.Бул ыкма учурда эң жетилген жана кеңири колдонулган жарым сандык ПТР ыкмасы болуп саналат.
Сунушталган qPCR машинасы:https://www.foreivd.com/mini-real-time-pcr-system-forequant-sf2sf4-product/
Fluorescent боёк ыкмасы (SYBR Green I):SYBR Green I - эки спиралдуу ДНКга спецификалык эмес байланышуучу сандык ПТР үчүн эң көп колдонулган ДНКны байланыштыруучу боёк.Эркин абалда SYBR Green алсыз флуоресценцияны бөлүп чыгарат, бирок бир жолу эки тилкелүү ДНК менен байланышкан, анын флуоресценциясы 1000 эсеге жогорулайт.Демек, реакция тарабынан чыгарылган жалпы флуоресценттик сигнал эки катарлуу ДНКнын санына пропорционалдуу жана күчөтүлгөн продуктунун көбөйүшү менен көбөйөт.Боёк кош тизмектүү ДНКга спецификалык эмес байланышта болгондуктан, жалган оң натыйжалар пайда болушу мүмкүн.
Тектеш азыктар: https://www.foreivd.com/real-time-pcr-easym-sybr-green-i-kit-product/
Fluorescent зонд ыкмасы (Такман технологиясы): учурундаПТР күчөтүү, белгилүү бир флуоресценттик зонд бир жуп праймер менен кошо кошулат.Зонд сызыктуу олигонуклеотид болуп саналат, анын эки учунда тиешелүү түрдө флуоресценттик репортер тобу жана флуоресценттик өчүргүч тобу белгиленген.Зонд бүтүн болгондо, кабарчылар тобу чыгарган флуоресценттик сигналды өчүрүүчү топ сиңирип алат, жана аныктоо Флуоресценттик сигнал жок;ПТР күчөтүү учурунда (кеңейтүү стадиясында) Taq ферментинин 5'-3' Дисер активдүүлүгү зондду сиңирет жана начарлатат, ошентип кабарчы флуоресценттик топ менен өчүрүүчү флуоресценттик топ бөлүнөт, ошентип флуоресценттик мониторинг системасы Флуоресценттик сигналды кабыл алууга болот, б.а. флуоресценттик сигналдардын топтолушу жана ПЦР продуктуларынын пайда болушу.Такман иликтөө ыкмасы клиникалык аныктоодо эң көп колдонулган аныктоо ыкмасы.
Тектеш азыктар: https://www.foreivd.com/quickeasy%e1%b5%80%e1%b4%b9-real-time-pcr-kit-taqman-product/
qPCR артыкчылыктары
1.Метод жетилген жана колдоочу жабдуулар жана реагенттер толук
2.Реагенттердин орточо баасы
3.колдонууга жеңил
4.Жогорку аныктоо сезгичтиги жана өзгөчөлүгү
qPCRдин кемчиликтери
Максаттуу гендин мутациясы өтүп кеткен аныктоого алып келет.
Төмөн концентрациялуу шаблонду аныктоонун натыйжасын аныктоо мүмкүн эмес.
Сандык аныктоо үчүн стандарттык ийри сызыкты колдонууда чоң ката бар.
3. Санариптик ПТР (санариптик ПТР, dPCR) технологиясы
Санариптик ПТР – бул нуклеин кислотасынын молекулаларынын абсолюттук сандык көрсөткүчү.qPCR менен салыштырганда, санариптик ПТР ДНК/РНК молекулаларынын санын түздөн-түз окуй алат, бул баштапкы үлгүдөгү нуклеин кислотасынын молекулаларынын абсолюттук сандык көрсөткүчү.1999-жылы Берт Фогельштейн жана Кеннет В. Кин-злер dPCR концепциясын расмий түрдө сунушташкан.
2006-жылы Fluidigm биринчи болуп коммерциялык чипке негизделген dPCR инструментин чыгарган.2009-жылы Life Technologies OpenArray жана QuantStudio 12K Flex dPCR системаларын ишке киргизди.2013-жылы Life Technologies үлгүлөрдү 20 000 жеке клеткага бирдей бөлүштүрүү үчүн жогорку тыгыздыктагы нано масштабдуу микрофлюиддик чип технологиясын колдонгон QuantStudio 3DdPCR системасын ишке киргизди.реакцияда жакшы.
2011-жылы Bio-Rad тамчыга негизделген QX100 dPCR инструментин ишке киргизди, ал үлгүнү 20 000 тамчы-суу-майга бирдей бөлүштүрүү үчүн мунайдагы суу технологиясын колдонот жана тамчыларды талдоо үчүн тамчы анализаторун колдонот.2012-жылы RainDance ар бир стандарттуу реакция системасын 1 миллиондон 10 миллионго чейин пиколитр деңгээлиндеги микро тамчыларды камтыган реакция эмульсиясына бөлүү үчүн RainDrop dPCR куралын ишке киргизди, ал жогорку басымдагы газ менен иштейт.
Буга чейин, санариптик ПТР эки негизги фракцияны түздү, чип түрү жана тамчы түрү.Кандай санариптик ПТР болбосун, анын негизги принциптери суюлтууну чектөө, ПТРдин акыркы чекити жана Пуассонду бөлүштүрүү болуп саналат.Нуклеиндик кислотанын шаблондорун камтыган стандарттуу ПТР реакция системасы он миңдеген ПТР реакцияларына бирдей бөлүнөт, алар чиптерге же микротамчыларга бөлүштүрүлөт, андыктан ар бир реакцияда мүмкүн болушунча шаблон молекуласы камтылат жана бир молекулалуу калыптуу ПТР реакциясы жүргүзүлөт.Флуоресценцияны окуу менен Сигналдын бар же жок экендиги эсептелет жана абсолюттук сандык аныктоо Пуассондун статистикалык бөлүштүрүлүшүн калибрлөөдөн кийин жүргүзүлөт.
Мен колдонгон бир нече санариптик ПТР платформаларынын мүнөздөмөлөрү төмөнкүлөр:
1. Bio-Rad QX200 тамчы санариптик ПТР Bio-RadQX200 – бул абдан классикалык санариптик ПТР платформасы, аныктоонун негизги процесси: 20 000 үлгү тамчы генератору тарабынан түзүлөт. Мунайдагы суу микро тамчылары кадимки ПТР машинасында күчөтүлөт жана акырында ар бир микро тамчынын флуоресценттик сигналы микро тамчы окугуч тарабынан окулат.Операция татаалыраак, булгануу коркунучу орточо.
Xinyi TD1 микро тамчы санариптик ПТРXinyi TD1 - бул ата мекендик санариптик ПТР платформасы, аныктоонун негизги процесси: тамчы генератору аркылуу 30,000-50,000 суунун мунай тамчыларын жаратып, жалпы ПТР аспабында күчөтүп, акырында тамчыны окугуч ар бир тамчынын флуоресценттик сигналын окуйт.Бул платформада тамчыларды түзүү да, окуу да булгануу коркунучу аз болгон атайын чипте аткарылат.
STILLA Naica микро тамчы чип санариптик ПТРSTILLA Naica салыштырмалуу жаңы санариптик ПТР платформа болуп саналат.Негизги аныктоо процесси: реакциялык эритмени чипке кошуп, чипти микро тамчыларды генерациялоо жана күчөтүү системасына салып, 30 000 микро тамчыларды жаратат.Чипте жайылып, чипте ПЦР күчөтүү аяктады.Андан кийин күчөтүлгөн чип микро тамчыларды окуу анализдөө системасына өткөрүлүп берилет жана флуоресценттик сигнал сүрөткө тартуу менен окулат.Бардык процесс жабык чипте ишке ашкандыктан, булгануу коркунучу аз.
4. ThermoFisher QuantStudio 3D чип санариптик ПТР
ThermoFisher QuantStudio 3D дагы бир классикалык чипке негизделген санариптик ПТР платформасы.Анын аныктоонун негизги процесси: реакция эритменин тараткычка кошуп, реакция эритмени тарагыч аркылуу 20 000 микроуюгу бар чипке тегиз жайыңыз., күчөтүү үчүн ПЦР машинасына чипти коюп, акырында чипти окурманга салып, флуоресценттик сигналды окуу үчүн сүрөткө тартыңыз.Операция салыштырмалуу татаал, бүт процесс жабык чипте жүргүзүлөт жана булгануу коркунучу аз.
5. JN MEDSYS Clarity чип санариптик ПТР
JN MEDSYS Clarity салыштырмалуу жаңы чип тибиндеги санариптик ПТР платформасы.Анын аныктоонун негизги процесси: реакция эритменин аппликаторго кошуу жана реакция эритмени аппликатор аркылуу ПТР түтүкчөсүнө бекитилген 10 000 ПТР түтүкчөлөрүнө тегиз жайылтуу.Микропороздуу чипте реакция эритмеси капиллярдык аракет аркылуу чипке кирет, ал эми чип менен ПТР түтүгү күчөтүү үчүн ПТР машинасына жайгаштырылат, акырында микросүрөткө тартуу менен флуоресценттик сигналды окуу үчүн микросхема окурманга киргизилет.Операция татаалыраак.Булгануу коркунучу төмөн.
Ар бир санариптик ПТР платформасынын параметрлери төмөнкүдөй жалпыланган:
Санариптик ПТР платформасынын баалоо индикаторлору болуп төмөнкүлөр саналат: бөлүү бирдиктеринин саны, флуоресценттик каналдардын саны, иштөөнүн татаалдыгы жана булгануу коркунучу.Бирок эң негизгиси аныктоонун тактыгы.Санариптик ПТР платформаларын баалоонун бир жолу - бири-бирин текшерүү үчүн бир нече санариптик ПТР платформаларын колдонуу, ал эми дагы бир жолу так баалуулуктары бар стандарттуу заттарды колдонуу.
dPCR артыкчылыктары
1.Абсолюттук сандык көрсөткүчкө жетишүү
2.Жогорку сезгичтик жана өзгөчөлүк
3.Төмөн көчүрмө үлгүлөрүн аныктай алат
dPCRдин кемчиликтери1. Кымбат жабдуулар жана реагенттер 2. Татаал операция жана узак аныктоо убактысы 3. Тар аныктоо диапазону
Азыркы учурда, ПТР технологиясынын үч мууну өзүнүн артыкчылыктары жана кемчиликтери бар жана ар биринин өзүнүн колдонуу чөйрөсү бар жана бир муун экинчи муундун ордун баса турган мамиле эмес.Технологиянын тынымсыз өнүгүшү ПТР технологиясына жаңы күчтөрдү киргизип, аны колдонуунун бир багытын экинчисинин кулпусун ачууга мүмкүндүк берип, нуклеин кислотасын аныктоону ыңгайлуураак жана так кылат.
Булак: Доктор Юан сизди текшерүүгө алып барат
Сунушталган продуктылар:
Посттун убактысы: Ноябрь-18-2022
