qPCR эксперименттеринде, праймер дизайны да абдан маанилүү шилтеме болуп саналат.Праймерлердин ылайыктуу же ылайыктуу эместиги күчөтүү эффективдүүлүгү стандартка жеткен-жетпегенине, күчөтүлгөн продуктулардын өзгөчөлүгүнө жана эксперименталдык натыйжалардын болушуна тыгыз байланыштуу.
Ошентип, qPCR праймеринин өзгөчөлүгүн кантип жакшыртса болот?Жогорку күчөтүү натыйжалуулугу?
Бүгүн биз сизди биргелешип qPCR праймерлерин долбоорлоого алып барабыз жана qPCR праймеринин дизайнын эксперименттерде эффективдүү билимге айландырууга мүмкүнчүлүк беребиз.
qPCR праймерлерин долбоорлоодо, адатта, төмөнкү пункттарга көңүл буруңуз: праймерлер мүмкүн болушунча интрондор боюнча иштелип чыгышы керек, продукттун узундугу 100-300 bp болушу керек, Tm мааниси 60°Cге мүмкүн болушунча жакын болушу керек, ал эми жогорку жана ылдыйкы праймерлер мүмкүн болушунча жакын болушу керек, ал эми праймердин аягы G же C болушу керек ж.б.
1. Интрондорду камтыган праймерлердин дизайны
qPCR праймерлерин долбоорлоодо, интрондор боюнча иштелип чыккан праймерлерди тандоо гДНК шаблонунун күчтөнүшүнө жол бербөө мүмкүн жана бардык продуктылар cDNAнын күчөтүлүшүнөн алынат, ошентип гДНКнын булганышынын таасирин жок кылат.
2. Праймер узундугу
Праймердин узундугу жалпысынан 18-30 нт ортосунда, ал эми күчөтүү продуктунун узундугун мүмкүн болушунча 100-300 bp ортосунда көзөмөлдөө керек.
Эгерде праймер өтө кыска болсо, анда ал спецификалык эмес күчөтүүгө алып келет, ал эми өтө узун болсо, ал оңой эле экинчилик структураны түзөт (мисалы, чачтын түзүлүшү).Эгерде күчөтүү продуктусу өтө узун болсо, ал полимераза реакциясы үчүн ылайыктуу эмес, бул ПТР күчөтүүнүн эффективдүүлүгүнө таасирин тийгизет.
3. GC мазмуну жана Tm мааниси
Праймерлердин GC мазмуну 40% жана 60% арасында көзөмөлдөнүшү керек.Эгерде ал өтө жогору же өтө төмөн болсо, ал реакцияны баштоого шарт түзбөйт.Бир эле Tm маанисин жана күйгүзүү температурасын алуу үчүн алдыга жана артка праймерлердин GC мазмуну бирдей болушу керек.
Tm мааниси мүмкүн болушунча 55-65°С ортосунда, жалпысынан 60°C тегерегинде болушу керек, ал эми агымдын өйдө жана төмөн жагындагы Tm мааниси мүмкүн болушунча жакын болушу керек, эң жакшысы 4°Сден ашпашы керек.
4. Праймердин 3′ учундагы А белгисин тандоодон качыңыз
Праймердин 3′ аягы дал келбеген учурда, ар кандай негиздер синтезинин эффективдүүлүгүндө чоң айырмачылыктар бар.Акыркы база А болгондо, ал дал келбеген учурда да чынжыр синтезин башташы мүмкүн, ал эми акыркы база T болгондо, дал келбеген индукциянын эффективдүүлүгү абдан төмөндөйт.Ошондуктан, праймердин 3′ учундагы А ны тандоодон качууга аракет кылыңыз, ал эми Тди тандаганыңыз жакшы.
Эгерде ал зонд праймери болсо, зонддун 5′ аягы G болушу мүмкүн эмес, анткени бир G базасы FAM флуоресценттик кабарчылар тобуна туташтырылганда да, G FAM тобу чыгарган флуоресценттик сигналды өчүрө алат, натыйжада жалган терс натыйжалар пайда болот.Пайда.
5. Базалык бөлүштүрүү
Праймердеги төрт негиздин бөлүштүрүлүшү жакшыраак кокустук болуп саналат, 3′ аягында 3ден ашык ырааттуу G же С жана 3төн ашык удаалаш болбошу керек.G же C GCге бай ырааттуу аймакта жупташтыруу оңой.
6. Primer долбоорлоо аймак татаал орто структураларды качышы керек.
Күчөтүү продуктунун бир жиптен пайда болгон экинчи структурасы ПТРдин жылмакай жүрүшүнө таасир этет.Максаттуу ырааттуулукта экинчилик структуранын бар же жок экенин алдын ала айтуу менен, праймерлерди долбоорлоодо бул аймактан качууга аракет кылыңыз.
7. Праймерлердин өздөрү жана праймерлердин ортосунда ырааттуу кошумча негиздерден качууга аракет кылуу керек.
Праймердин өзү менен праймердин ортосунда ырааттуу 4 негиз толуктоосу болушу мүмкүн эмес.Праймердин өзү толуктоочу ырааттуулукка ээ болбошу керек, антпесе ал бүктөлүп, чач кычкач түзүлүшүн пайда кылат, бул праймер менен шаблондун күйгүзүүчү айкалышына таасирин тийгизет.
Кошумча ырааттуулук жогору жана ылдыйкы праймерлердин ортосунда болушу мүмкүн эмес.Праймерлердин ортосундагы толуктоо ПТР эффективдүүлүгүн төмөндөтүүчү, ал тургай, сандык тактыкка таасир этүүчү праймер димерлерин чыгарат.Primer-dimer жана hairpin структуралар сөзсүз болсо, △G мааниси өтө жогору болбошу керек (4,5 ккал/моль кем болушу керек).
8. Праймерлер максаттуу конкреттүү продуктуну күчөтөт.
qPCR аныктоонун акыркы максаты - максаттуу гендин көптүгүн түшүнүү.Эгерде спецификалык эмес күчөтүү пайда болсо, сандык аныктоо так эмес болот.Ошондуктан, праймерлер иштелип чыккандан кийин, алар BLAST тарабынан сыналышы керек жана продукциянын өзгөчөлүгү ырааттуулук базасында салыштырылат.
Андан кийин, qPCR праймерлерин долбоорлоо үчүн мисал катары адамдын GAS6 (Growth arrest specific 6) генин алабыз.
01 суроо ген
Homo GAS6NCBI аркылуу.Бул жерде гендердин атын жана түрлөрүн салыштырууга көңүл бурушубуз керек.
02 ген тизмегин табыңыз
(1) Эгерде максаттуу ырааттуулук геномдук ДНК болсо, гендин геномдук ДНК тизмеги болгон биринчисин тандаңыз.
(2) Эгерде максаттуу ырааттуулук мРНК болсо, экинчисин тандаңыз.Киргизгенден кийин, төмөнкү таблицадагы "CDS" баскычын чыкылдатыңыз.Күрөң фон ырааттуулугу гендин коддоо ырааттуулугу.
03 Дизайн праймерлери
Primer-BLAST интерфейсине кириңиз
Жогорку сол жактагы гендин катар номерин же Fasta форматындагы ырааттуулукту киргизип, тиешелүү параметрлерди толтуруңуз.

"Праймерлерди алуу" баскычын чыкылдатыңыз жана NCBI пайда болот, мындай параметр тандоо башка сплайндик варианттарга күчөтүлөт.Биз ар кандай бириктирүү варианттарын текшерип, аларды тиешелүү праймер жуптарын алуу үчүн тапшыра алабыз (төмөндөгү сүрөттө көрсөтүлгөндөй).Бул процессти иштетүү үчүн ондогон секунд талап кылынышы мүмкүн.
Бул праймер жуптардын күйдүрүү температурасы 60°C тегерегинде.Эксперименттин максатына ылайык, орточо узундуктагы, жакшы спецификалуу жана эксперимент үчүн праймерлердин өзүн-өзү толуктоосу аз праймерлерди тандаңыз жана ийгилик деңгээли кыйла жогору!
04Праймердин өзгөчөлүгүн текшерүү
Чынында, праймерлерди долбоорлоодон тышкары, Primer-Blast биз өзүбүз иштеп чыккан праймерлерди да баалай алат.Праймер дизайны барагына кайтыңыз, биз иштеп чыккан өйдө жана ылдыйкы праймерлерди киргизиңиз жана башка параметрлер туураланбайт.Тапшыргандан кийин, жуп праймер башка гендерде да бар же жок экенин көрө аласыз.Эгерде алардын бардыгы генде көрсөтүлсө, биз күчөтүүнү каалайбыз, бул бул жуп праймерлердин өзгөчөлүгү чоң экенин көрсөтүп турат!(Мисалы, бул негизги суроонун жалгыз натыйжасы!)

05 Праймердин сапатын баалоо
"Стандартты чейин күчөтүү эффективдүүлүгүн", "күчөтүлгөн продукттун мүнөздөмөлөрүн" жана "ишенимдүү эксперименталдык натыйжаларды" айкалыштырган "мыкты" праймер кандай праймер?
Күчөтүү натыйжалуулугу

эрүү ийри
Праймерлердин күчөтүү эффективдүүлүгү 90%-110% жетет, бул күчөтүү эффективдүүлүгү жакшы, ал эми эрүү ийри сызыгы бир чокуга ээ жана адатта Tm>80°C, бул күчөтүү өзгөчөлүгү жакшы дегенди билдирет.
 
Тектеш продуктылар:
Real Time PCR Easy–SYBR GREEN I
Real Time PCR Easy-Taqman