Ct мааниси флуоресценттик сандык ПТРдин эң маанилүү натыйжасы болуп саналат.Бул ген экспрессия айырмачылыктарды же ген көчүрмө санын эсептөө үчүн колдонулат.Ошентип, флуоресценциянын Ct мааниси кандай деп эсептелет?Ct маанисинин эффективдүү диапазонун кантип камсыз кылуу керек?

Ct Value деген эмне?
qPCR күчөтүү процессинде, күчөтүлгөн продуктунун флуоресценция сигналы белгиленген флуоресценция босогосуна жеткенде, күчөтүү циклдарынын тийиштүү саны (Цикл босогосу).C Cycle жана T босогону билдирет.Жөнөкөй сөз менен айтканда, Ct мааниси qPCRде баштапкы калыптын күчөтүлүшү продуктунун белгилүү бир көлөмүнө жеткенде тиешелүү циклдердин саны.«Продукциянын белгилүү бир көлөмү» деп аталган нерсе кийинчерээк түшүндүрүлөт.

Ct мааниси эмне кылат?

1.Экспоненциалдык күчөтүү, шаблон өлчөмү жана Ct маанисинин ортосундагы байланыш
Идеалында, qPCRдеги гендер циклдердин белгилүү бир санынан кийин экспоненциалдык күчөтүү жолу менен топтолот.Күчөтүү циклдарынын саны менен продукциянын көлөмүнүн ортосундагы байланыш: Күчөтүлгөн продукт суммасы = баштапкы шаблон суммасы × (1+En) циклдердин саны.Бирок, qPCR реакциясы дайыма эле идеалдуу абалда боло бербейт.Күчөтүлгөн продуктунун көлөмү "белгилүү бир продукт көлөмүнө" жеткенде, бул учурда циклдердин саны Ct мааниси болуп саналат жана ал экспоненциалдык күчөтүү мезгилинде болот.Ct мааниси менен баштапкы калыптын суммасынын ортосундагы байланыш: Калыптын Ct мааниси менен шаблондун баштапкы көчүрмө номеринин логарифминин ортосунда сызыктуу байланыш бар.Калыптын баштапкы концентрациясы канчалык жогору болсо, Ct мааниси ошончолук аз болот;баштапкы калыптын концентрациясы канчалык төмөн болсо, Ct мааниси ошончолук чоң болот.

2.Amplification ийри, fluorescence чеги жана белгилүү ПТР продукт суммасы
qPCR күчөтүү продуктунун көлөмү түз флуоресценттик сигнал түрүндө, башкача айтканда, күчөтүү ийри сызыгында көрсөтүлөт.ПТРдин алгачкы стадиясында күчөтүү идеалдуу шарттарда жүрөт, циклдердин саны аз, продуктунун топтолушу аз жана флуоресценциянын деңгээлин флуоресценттик фондон так ажыратууга болбойт.Андан кийин флуоресценция көбөйүп, экспоненциалдык фазага өтөт.ПЦР продуктунун көлөмүн ПЦР реакциясы экспоненциалдык фазада болгон учурда аныктоого болот, аны “продукциянын белгилүү бир көлөмү” катары колдонууга болот жана шаблондун баштапкы мазмунун ушундан чыгарууга болот.Демек, флуоресценттик сигналдын интенсивдүүлүгү продуктунун белгилүү бир өлчөмүнө туура келген флуоресценция босогосу болуп саналат.

ПТРдин кеч стадиясында күчөтүү ийри сызыгы экспоненциалдык күчтөнүүнү көрсөтпөй, сызыктуу фазага жана плато фазасына кирет.

3.Ct баалуулуктарынын кайталанышы
ПЦР цикли Ct маанисинин цикл номерине жеткенде, ал жаңы эле чыныгы экспоненциалдык күчөтүү мезгилине кирди.Бул учурда, кичинекей ката күчөтүлгөн эмес, ошондуктан Ct маанисинин кайталануучулугу мыкты, башкача айтканда, бир эле шаблон ар кандай убакта же бир эле учурда ар кандай түтүкчөлөрдө күчөтүлөт.Күчөтүү, алынган Ct мааниси туруктуу.

1.Ampplification натыйжалуулугу En
ПТР күчөтүү эффективдүүлүгү полимераздын күчөтүлө турган генди ампликонго айландырган эффективдүүлүгүн билдирет.Бир ДНК молекуласы эки ДНК молекуласына айландырылганда күчтөндүрүү эффективдүүлүгү 100% түзөт.Күчөтүү натыйжалуулугу көбүнчө En катары көрсөтүлөт.Кийинки макалаларды талдоону жеңилдетүү максатында, күчөтүү эффективдүүлүгүнө таасир этүүчү факторлор кыскача келтирилген.

2.Ct маанилеринин диапазону
Ct маанилери 15-35 чейин.Эгерде Ct мааниси 15тен аз болсо, анда күчөтүү базалык мезгилдин чегинде жана флуоресценция босогосуна жете элек деп эсептелет.Идеалында, Ct мааниси менен шаблондун баштапкы көчүрмө санынын логарифминин, башкача айтканда, стандарттык ийри сызыктын ортосунда сызыктуу байланыш бар.Стандарттык ийри сызык аркылуу, күчөтүү эффективдүүлүгү 100% болгондо, гендин бир нускасынын санын аныктоо үчүн эсептелген Ct мааниси 35тин тегерегинде. Эгерде ал 35тен көп болсо, шаблондун баштапкы нускасынын саны теориялык жактан 1ден аз болот, муну маанисиз деп эсептөөгө болот.

Ар түрдүү ген Ct диапазондору үчүн, ген көчүрмөлөрүнүн санынын айырмасынан жана баштапкы калыптын өлчөмүндөгү күчтөндүрүү эффективдүүлүгүнөн улам, ген үчүн стандарттуу ийри сызык түзүү жана гендин сызыктуу аныктоо диапазонун эсептөө зарыл.

3. Ct маанисинин таасир этүүчү факторлору
Күчөтүү циклдеринин саны менен продуктунун көлөмүнүн ортосундагы байланыштан: күчөтүлгөн продуктунун суммасы = баштапкы шаблондун көлөмү × (1+En) цикл саны, идеалдуу шарттарда баштапкы калыптын жана En көлөмүнүн Ct маанисине терс таасирин тийгизерин көрүүгө болот.Калыптын сапаты же күчөтүү эффективдүүлүгүнүн айырмасы Ct маанисинин өтө чоң же өтө кичине болушуна алып келет.

4.Ct мааниси өтө чоң же өтө кичине