ПЦР, көп ПЦР, In situ ПЦР, Тескери ПТР, RT-PCR, qPCR（1）–ПЦР

Биз ар кандай ПТРдин түшүнүктөрүн, кадамдарын жана майда-чүйдөсүнө чейин иргеп чыгабыз

Ⅰ. ПЦР

Полимераздык чынжыр реакциясы, ПТР деп аталган, белгилүү ДНК фрагменттерин чоңойтуу үчүн колдонулган молекулярдык биологиялык технология.Бул өзгөчө ДНК репликациясы катары каралышы мүмкүн in vitro .ДНК-полимераза (ДНК Полимераза I) 1955-жылы эле ачылган, ал эми эксперименталдык баалуулугу жана практикалык мааниси бар E. Coli'нин Кленов фрагментин 1970-жылдардын башында доктор Х.Кленов ачкан, бирок бул фермент температурага чыдабагандыктан, жогорку температура аны начарлатышы мүмкүн, ошондуктан ал полимеразанын жогорку температуралык реакциясына жооп бербейт.Бүгүнкү күндө колдонулуп жаткан ферменттер (Taq полимераза деп аталат) 1976-жылы Thermus aquaticus, ысык булак бактериясынан бөлүнүп алынган. Анын өзгөчөлүгү - ал жогорку температурага туруштук бере алат жана идеалдуу фермент, бирок 1980-жылдардан кийин кеңири колдонулат.ПТРдин баштапкы примитивдүү прототипинин оригиналдуу концепциясы генди оңдоого жана көчүрүүгө окшош, аны 1971-жылы доктор КЖелл Клеппе сунуш кылган. Ал биринчи жөнөкөй жана кыска мөөнөттүү ген көчүрмөсүн жарыялаган (ПЦРдин алгачкы эки цикл реакциясына окшош).Бүгүнкү күндө иштелип чыккан ПТР 1983-жылы доктор Кари Б. Муллис тарабынан иштелип чыккан. Доктор Маллис ошол жылы PE компанияларына кызмат кылган, ошондуктан ПТР тармагында PE өзгөчө статуска ээ.Доктор Муллис расмий түрдө 1985-жылы Сайки жана башкалар менен байланышкан биринчи кагазды жарыялаган. Ошондон бери ПТРди колдонуу күнүнө миңдеген миль аралыкты түзөт жана тиешелүү документтердин сапаты башка көптөгөн изилдөө ыкмаларын жагымсыз кылат деп айтууга болот.Кийинчерээк ПЦР технологиясы биологиялык илимий изилдөөлөрдө жана клиникалык колдонмолордо кеңири колдонулуп, молекулярдык биологияны изилдөөнүн эң маанилүү технологиясына айланган.Муллис 1993-жылы химия боюнча Нобель сыйлыгын да алган.

ПЦРПринцип

ПТР технологиясынын негизги принциби ДНКнын табигый репликация процессине окшош жана анын спецификасы максаттуу ырааттуулуктун эки учун толуктоочу олигонуклеотиддик праймерден көз каранды.ПТР дегенерация-жаруу-узартуу үч негизги реакциянын этаптарынан турат: ①Шаблон ДНКсынын дегенерациясы: Калып ДНК белгилүү бир убакытка 93°Cге чейин ысытылгандан кийин, калыптын ПТР күчөтүүсүнөн пайда болгон кош чынжырлуу ДНК үчүн кош ДНК эритмеси аны ДНКны бир катарлаш үчүн даярдай алат. тегерек реакция.②Шаблон ДНКсынын жана праймердин күйгүзүлүшү (кошулушу): Шаблон ДНКсы ысытылгандан жана бир чынжырга бузулгандан кийин, температура болжол менен 55°Cге чейин төмөндөйт.Праймердин жана калыптын ДНКсынын бир чынжырлуу толуктоочу ырааттуулугу.③Праймердин узартылышы: ДНК шаблону-праймердин байланышы TaqDNA полимеразанын аракетине негизделген, реакция чийки заты катары dNTP.Репликация принцибин сактаңыз, ДНК үлгүсүнүн чынжырын толуктаган жаңы жарым резервдик көчүрмө чынжырын синтездеңиз жана кайталануучу цикл дегенерация-аннеализация-узартуу үч процесс көбүрөөк “жарым резервдик көчүрмө чынжырын” ала алат жана бул жаңы чынжыр кайра жеткиликтүү Кийинки цикл үчүн шаблон болуңуз.Бул циклди аяктоо үчүн 2-4мин талап кылынат, максаттуу ген 2-3 сааттын ичинде бир нече миллион жолу күчөтүүгө болот.

СтандартПЦРРеакция системасы

ПЦР реакциясынын беш элементи

ПЦР реакциясына катышкан заттардын негизинен беш түрү бар, атап айтканда, праймер, фермент, dNTP, шаблон жана буфер (Mg2+ талап кылынат).[ПТР процедурасы]

Стандарттык ПТР процесси үч кадамга бөлүнөт

1. ДНК дегенерация (90°C-96°C): Кош чынжырлуу ДНК шаблондору термикалык таасир астында, суутек байланыштары үзүлүп, бир чынжырлуу ДНКны түзөт.

2. Annealing (25℃ -65℃): Системанын температурасы төмөндөйт, праймер жергиликтүү кош чынжырды түзүү үчүн ДНК шаблону менен бириктирилет.

3. Узартуу (70℃ -75℃): Taq энзиминин аракети астында (болжол менен 72°C, эң жакшы активдүүлүк), чийки зат катары dNTP колдонулат, праймердин 5′ учунан → 3′ аягына чейин созулат, синтез жана шаблон бири-бирин ДНК чынжырын толуктайт.

Ар бир цикл денатуратталган, күйгөн жана узартылган, ДНКнын мазмунун эки эсеге көбөйтөт.Азыркы учурда, кыска күчөтүү аянтына байланыштуу, Taq ферментинин активдүүлүгү оптималдуу болбосо дагы, кээ бир ПТР өтө кыска убакыттын ичинде кайталанышы мүмкүн, ошондуктан аны эки кадамга өзгөртүүгө болот, башкача айтканда, күйдүрүү жана узартуу бир эле учурда 60 ° C-65 ° C температурада жүргүзүлүшү мүмкүн.көтөрүү жана муздатуу процессин азайтуу жана жооп ылдамдыгын жакшыртуу максатында.

ПЦР реакциясынын өзгөчөлүктөрү

● Жогорку өзгөчөлүк

ПЦР реакциясынын спецификалык чечүүчү факторлору болуп төмөнкүлөр саналат: ①Праймер менен ДНК шаблонунун спецификалык айкалышы.②Базалык жупташтыруу принциби.③ТакДНК полимераза синтез реакциясынын лоялдуулугу.④Максаттуу гендин өзгөчөлүгү жана консервативдүүлүгү.

Праймерлердин жана шаблондордун туура айкалышы ачкыч болуп саналат.Праймерди жана шаблонду бириктирүү жана праймер чынжырын узартуу щелочтук негиздин дал келүү принцибине негизделген.Полимераздын синтез реакцияларынын лоялдуулугу жана реакциядагы шаблон менен праймердин байланышын (кошумчасын) жасоо үчүн Так ДНК полимеразасынын жогорку температурага туруктуулугу жогорку температурада аткарылышы мүмкүн.Комбинациянын специфика-лыктыгы абдан жогорулады.Клип жогорку деңгээлдеги тууралыкты сактай алат.жогорку консервативдик жана жогорку консервативдик максаттуу генетикалык аймакты тандоо менен, анын өзгөчөлүгү жогору болот.

● Жогорку сезгичтик

ПЦР продукциясынын өндүрүш көлөмү индекс боюнча көбөйтүлөт, ал микроконтроллердин деңгээлин микрограммдардын деңгээлине (мкг= -6) жогорулатуу үчүн Пикердин (PG=10-12) баштапкы шаблонун кеңейте алат.Максаттуу клеткаларды 1 миллион клеткадан аныктоого болот;вирустарды аныктоодо ПТРдин сезгичтиги 3 РФУга жетиши мүмкүн (бош тактар ​​түзүлөт бирдиктер);бактерия илиминде минималдуу аныктоо ылдамдыгы 3 бактерия болуп саналат.

● Жөнөкөй жана тез

ПТР чагылдыруусу жогорку температурадагы Taq ДНК полимеразасын колдонот, ал бир убакта реакция эритмесин кошот, башкача айтканда, ДНКны күчөтүү эритмесинде жана суу мончосунда дегенерация-аннеал-узартуу реакциясы.Негизинен, күчөтүү реакциясы 2-4 саатта аяктайт.Көбөйтүлгөн өнүмдөр жалпысынан электр кылычынын жардамы менен талданат жана изотопторду колдонуунун кереги жок, радиоактивдүү булгануу жок жана жылдыруу оңой.

● Үлгүнүн тазалыгы төмөн

Вирустарды же бактерияларды жана маданият клеткаларын бөлүүнүн кереги жок.ДНК чийки продуктулары жана РНК күчөткүч катары колдонулушу мүмкүн.ДНКны күчөтүүнү аныктоону кан, дене суюктугу, жөтөлдү жуугуч суюктук, чач, клеткалар жана тирүү кыртыш сыяктуу клиникалык үлгүлөрдү колдонуу менен түздөн-түз колдонсо болот.

ПЦРжалпы көйгөйлөр

● Жалган терс, күчөтүлгөн тилкелер жок

ПТР реакциясынын негизги этаптарына төмөнкүлөр кирет: ① шаблон нуклеиндик кислоталарды даярдоо, ② праймерлердин сапаты жана спецификасы, ③ ферменттердин сапаты ④ ПТР циклинин шарттары.Себебин табуу да жогорудагы шилтемелер үчүн талдоо жана изилдөө керек.

Калыптар: ① Шаблон ар кандай протеинди камтыйт, ② Калыпта Taq ферментинин ингибитору бар, ③ Калыптагы белок жок кылынбайт, өзгөчө хромосомадагы топтук белок.⑤ Деминер нуклеиндик кислотанын бузулушу толук эмес.Ферменттердин жана праймерлердин сапаты жакшы болгондо, күчөтүү тилкеси жок, бул үлгүлөрдүн сиңирүү процесси болуп саналат.Калыптын нуклеин кислотасын алуу процессинде бир нерсе туура эмес, ошондуктан эффективдүү жана туруктуу эритмени даярдоо үчүн анын процедурасы бекитилип, өзүм билемдик менен өзгөртүлбөшү керек.

Ферментти инактивациялоо: ферменттин активдүүлүгүнүн жоголуп же жетишсиздигин анализдөө үчүн жаңы фермент же эски жана жаңы ферменттер бирге колдонулушу керек, бул жалган негативдерге алып келет.Белгилей кетсек, Taq ферменти же этидий бромиди кээде унутулуп калат.

Primer: праймердин сапаты, праймердин концентрациясы жана эки праймердин концентрациясы симметриялуубу.Бул ПТР жетишсиздигинин жалпы себеби же өсүп жаткан тилке идеалдуу эмес жана диффузияга жакын.Кээ бир сериялык номерлердин праймерлеринин сапатында көйгөйлөр бар.Эки праймер жогорку концентрацияга жана аз концентрацияга ээ, бул аз эффективдүү асимметриялык күчөтүүнү пайда кылат.Каршы чаралар: ① Бирдиктерди синтездөө үчүн жакшы праймерди тандаңыз.② Праймердин концентрациясы OD маанисине гана көз каранды болбостон, агар кант гелинин электрофорезин жасоо үчүн праймердин баштапкы суюктугуна да көңүл бурат.Праймер тилкесинин зонасы болушу керек жана эки праймердин жарыктыгы жалпысынан бирдей болушу керек.Belt, ПТР бул учурда иштебей калышы мүмкүн жана аны праймер синтези бирдиги менен чечүү керек.Эгерде праймер жогору болсо, жарыктык төмөн, ал эми анын концентрациясы суюлтулганда тең салмактуу болушу керек.③ Праймерди муздаткычтын бир нече тоңдуруу же узак мөөнөттүү муздаткыч бөлүктөрүнүн алдын алуу үчүн төлөп, жогорку концентрацияда сактоо керек, бул праймердин начарлашына жана бузулушуна алып келет.④ Праймердин конструкциясы негизсиз, мисалы, праймердин узундугу жетишсиз жана праймерлердин ортосунда ди кластер түзүлөт.

Mg2+концентрациясы: Mg2+ион концентрациясы ПТР күчөтүү эффективдүүлүгүнө чоң таасирин тийгизет.Ашыкча концентрация ПТР күчөтүү карама-каршы жынысын азайтышы мүмкүн.Эгерде концентрация өтө төмөн болсо, ПТР күчөтүү натыйжасы кеңейтүү тилкеси жок эле ПТР күчөтүү иштебей калышына алып келет.

Реакция көлөмүнүн өзгөрүшү: ПТР күчөтүүдө колдонулган көлөм 20ul, 30ul жана 50ul же 100uL, ПЦР күчөтүү үчүн өтүнмөнүн чоң көлөмү илимий изилдөөлөрдүн жана клиникалык тестирлөөнүн ар кандай максаттарына ылайык белгиленет.20ул сыяктуу кичинекей көлөмдөрдү жасагандан кийин, размер жасаганда шнур шартын жасоо керек, антпесе ал ишке ашпай калат.

Физикалык себептер: Трансформация ПЦР күчөтүү үчүн абдан маанилүү.Эгерде бузулуу температурасы төмөн болсо, бузулуу убактысы кыска, ал жалган негативдерде пайда болушу мүмкүн;өтө төмөн күйгүзүү температурасы спецификалык эмес күчөтүүгө алып келиши мүмкүн жана өзгөчө күчөтүү натыйжалуулугун төмөндөтөт.ПЦР күчөтүү эффективдүүлүгүн төмөндөтүү үчүн праймерлер менен шаблондордун айкалышы катуу таасир этет.Кээде ПТРдин иштебей калышынын себептеринин бири болгон кеңейтүүчү же сууда эрүүчү мештеги өзгөргүчтүктү, күйүүнү жана узартылган температураны аныктоо үчүн стандарттуу термометрлерди колдонуу керек.

Максаттуу ырааттуулуктун варианттары: Эгерде максаттуу ырааттуулук пайда болсо, мутация же жок кылынса, прототип менен шаблондун айкалышы айкалышса, же максаттуу ырааттуулуктун жоктугунан, праймер жана шаблон толуктоочу ырааттуулукту жоготот, жана анын ПТР күчөтүү ийгиликтүү болбойт.

● Жалган оң

ПТР күчөтүү тилкеси максаттуу ырааттуу тилкеге ​​ылайыктуу көрүнөт, кээде анын тилкеси тыкан жана жогорураак болот.

Праймердин конструкциясы ылайыктуу эмес: тандалган күчөтүү ырааттуулугу жана максаттуу эмес күчөтүү ырааттуулугу гомологго ээ, ошондуктан ПТР күчөтүлгөндө, күчөтүлгөн ПТР продуктулары максатсыз ырааттуулук болуп саналат.Максаттуу ырааттуулук өтө кыска же праймер өтө кыска жана ал жалган позитивге жакын.Кайра конструкциялоо керек.

Максаттуу ырааттуулуктун же күчөтүү продуктуларынын кайчылаш булганышы: Бул булгануунун эки себеби бар: Биринчиден, бүт геномдун же чоң сегменттердин кайчылаш булганышы, жалган позитивдерге алып келет.Мындай жалган позитивди төмөнкү ыкмалар менен чечсе болот: Иштеп жатканда этият жана жумшак болуңуз, максаттуу ырааттуулугу үлгүдөгү тапанчага дем алуудан же борбордон тепкич түтүктөн чачырап кетпесин.Жогорку температурага туруштук бере албаган ферменттерден жана заттардан башка бардык реагенттерди же жабдууларды жогорку басым менен дезинфекциялоо керек.Борбордон четтөөчү түтүктөрдү жана үлгүлөрдү бир эле учурда колдонуу керек.Зарыл болгон учурда үлгүлөрдү кошуунун алдында реакциялык түтүккө жана реагентке болгон нуклеин кислотасын жок кылуу үчүн ультрафиолет нурларынын таасири коюлат.Экинчиден, абанын булганышынын майда фрагменттери.Бул кичинекей фрагменттер максаттуу ырааттуулуктан кыскараак, бирок алар белгилүү гомологияга ээ.Аны бири-бири менен бириктирсе болот.Праймерлерди толуктагандан кийин, ПТР продуктусун кеңейтүүгө болот, бул жалган оң өндүрүштү пайда кылат.Бул уя ПТР ыкмасын азайтуу же жок кылуу үчүн колдонулушу мүмкүн.

● Белгилүү эмес күчөтүү тилкеси пайда болот

ПЦР күчөтүүдөн кийин пайда болгон тилкелер күтүлгөн чоңдукка же чоң же кичинеге, же ошол эле учурда, же ошол эле учурда белгилүү бир күчөтүү тилкелерине жана спецификалык эмес күчөтүү тилкелерине туура келбейт.Өзгөчө эмес тилкелердин пайда болушу: Биринчиден, праймерлер максаттуу ырааттуулукка толук эмес кошумча болуп саналат, же ди кластер түзүү үчүн праймердин полимеризациясы.Экинчиси, MG2+ иондорунун концентрациясы өтө жогору, күйгүзүү температурасы өтө төмөн жана ПТР циклдарынын саны байланыштуу.Экинчиден, ферменттердин сапаты жана саны.Көбүнчө, кээ бир булактардын ферменттери атайын эмес тилкелерге жакын болот жана башка булактын ферменттери пайда болбойт.Кээде ферменттердин спецификалык эмес күчөшү да болот.Каршы чаралар болуп төмөнкүлөр саналат: зарыл болгон учурда кайра долбоорлонгон тартуулар.Ферменттин көлөмүн азайтыңыз же башка булактын ферментин алмаштырыңыз.Негизги көлөмүн азайтыңыз, калыптардын санын тийиштүү түрдө көбөйтүңүз жана циклдердин санын азайтыңыз.Туура annealing температурасын жогорулатуу же эки температура пункту ыкмасын колдонуу (93 ° C дегенерация, annealing жана болжол менен 65 ° C узартуу).

● Кабырчык же жабышчаак лента пайда болот

ПЦР күчөтүү кээде колдонулат же кабыкча же килем сыяктуу кур көрүнөт.Себеби, ферменттердин ашыкча көлөмү же ферменттин сапаты начар болгондуктан, dNTP концентрациясы өтө жогору, Mg2+ концентрациясы өтө жогору, күйгүзүү температурасы өтө төмөн жана циклдердин саны өтө көп.Каршы чаралар: ①ферменттердин санын азайтуу же башка булактын ферментин өзгөртүү.②dNTP концентрациясын азайтыңыз ③Mg2+ концентрациясын туура азайтыңыз.④Шаблондордун санын көбөйтүңүз жана циклдердин санын азайтыңыз.

Related Products

PCR Heroᵀᴹ (Боёк менен)

◮ Жогорку тактык: кадимки Taq ферментинен 6 эсе көп;

◮ Тезирээк күчөтүү ылдамдыгы

◮ Шаблондун көбүрөөк ыңгайлашуусу

◮ Жогорку күчөтүү натыйжалуулугу

◮ Экологиялык толеранттуулук күчтүүрөөк: 90%дан ашык активдүүлүктү сактап, бир жума бою 37°C температурада жайгаштырылган;

◮ Ал 5'→3' ДНК полимераза активдүүлүгүнө жана 5'→3' экзонуклеаза активдүүлүгүнө ээ, 3'→5' экзонуклеаза активдүүлүгү жок.

PCR Easyᵀᴹ (Боёк менен)

Уникалдуу реакция системасы жана жогорку эффективдүү Taq DNA Polymerase ПТР реакциясын күчөтүү эффективдүүлүгүн, өзгөчөлүгүн жана сезгичтигин жогору кылат.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (One Step)-SYBR Green I

◮ Бир кадамдуу комплект бир эле түтүктө тескери транскрипцияны жана qPCR эки реакциясын жасайт, РНК шаблонун, конкреттүү ПТР праймерлерин жана RNase-Free ddH кошуу керек.₂O.

◮ Комплект вирустук РНКны же РНКны издөөнү тез жана натыйжалуу сандык анализдей алат.

◮ Комплект реакциянын күчөтүү эффективдүүлүгүн жана өзгөчөлүгүн эффективдүү жакшыртуу үчүн уникалдуу Foregene тескери транскрипция реагентин жана Foregene HotStar Taq ДНК Полимеразасын уникалдуу реакция системасы менен айкалыштырат.

◮ Оптимизацияланган реакция системасы реакциянын жогорку сезгичтүүлүгүнө, күчтүү жылуулук туруктуулугуна жана жакшыраак толеранттуулукка ээ кылат.

◮ RT-qPCR Easy^TM(One Step)-SYBR Green I комплекти ROX ички маалымдама боёгу менен келет, ал сигналдын фонун жана скважиналардын ортосундагы сигнал каталарын жоюу үчүн колдонулушу мүмкүн, бул кардарларга сандык ПТР аспаптарынын ар кандай моделдеринде колдонууга ыңгайлуу.

RT Easy^TMII (Мастер Premix үчүн үчүн биринчи катардагы кДНК синтезиреалдуу убакыт ПТР)

-2 мүнөттүн ичинде шаблондогу гДНКны жок кыла турган гДНКны жок кылуунун эффективдүү мүмкүнчүлүгү.

- Эффективдүү тескери транскрипция системасы, cDNAнын биринчи тилкесинин синтезин аяктоо үчүн болгону 15 мүнөт талап кылынат.

-Татаал шаблондор: жогорку GC мазмуну жана татаал экинчи структурасы бар шаблондор да жогорку эффективдүүлүк менен артка кайтарылышы мүмкүн.

-Жогорку сезгичтиктеги тескери транскрипция системасы, pg деңгээлиндеги шаблондор да жогорку сапаттагы cDNA ала алат.

-Тескери транскрипция системасы жогорку жылуулук туруктуулугуна ээ, оптималдуу реакция температурасы 42 ℃ жана ал дагы эле 50 ℃ тескери транскрипциянын жакшы көрсөткүчүнө ээ.