ПТР (полимераздык чынжыр реакциясы) 30 жылдан ашык тарыхы бар ДНКны күчөтүү in-vitro технологияларынын бири.

ПТР технологиясын 1983-жылы АКШдагы Цетус штатынан Кари Муллис пионер болуп ачкан. Муллис 1985-жылы ПТР патентине кайрылган жана ошол эле жылы Илим боюнча биринчи ПТР академиялык макаласын жарыялаган.Муллис бул эмгеги үчүн 1993-жылы химия боюнча Нобель сыйлыгына татыктуу болгон.

ПЦРдин негизги принциптери

ПТР максаттуу ДНК фрагменттерин миллиондон ашык эсеге көбөйтө алат.Принцип ДНК полимеразанын катализинде, калып катары ДНКнын ата-эне тилкесин жана кеңейтүү үчүн баштапкы чекит катары спецификалык праймерди колдонот.Ал денатурация, күйдүрүү жана узартуу сыяктуу кадамдар аркылуу in vitro репликацияланат.ДНКнын ата-эне тилкесинин шаблонуна толуктоочу кыз тилкесинин ДНК процесси.

Стандарттык ПТР процесси үч баскычка бөлүнөт:

1.Denaturation: ДНКнын кош жиптерин бөлүү үчүн жогорку температураны колдонуңуз.ДНКнын кош тилкелеринин ортосундагы суутек байланышы жогорку температурада (93-98℃) үзүлөт.

2.Annealing: Кош тизмектүү ДНК бөлүнгөндөн кийин, праймер бир тилкелүү ДНКга байланышы үчүн температураны төмөндөтүңүз.

3.Extension: ДНК полимераза температураны төмөндөткөндө байланышкан праймерлерден ДНК тилкелери боюнча комплементарлык тилкелерди синтездей баштайт.Кеңейтүү аяктаганда бир цикл бүтөт жана ДНК фрагменттеринин саны эки эсеге көбөйөт

Бул үч кадамды 25-35 жолу кайталаса, ДНК фрагменттеринин саны экспоненциалдуу түрдө көбөйөт.

ПЦРдин тапкычтыгы – ар кандай праймерлердин ар кандай максаттуу гендер үчүн иштелип чыгышы, ошондуктан максаттуу ген фрагменттери кыска убакыттын ичинде күчтөндүрүлүшү мүмкүн.

Буга чейин, ПТР үч категорияга бөлүүгө болот, атап айтканда, жөнөкөй ПТР, флуоресценттик сандык ПТР жана санариптик ПТР.

Кадимки ПТРдин биринчи мууну

Максаттуу генди күчөтүү үчүн кадимки ПТР күчөтүү инструментин колдонуңуз, андан кийин продуктуну аныктоо үчүн агароз гел электрофорезин колдонуңуз, сапаттык анализди гана жасоого болот.

Биринчи муундагы ПТРдин негизги кемчиликтери:

1.Проне спецификалык эмес күчөтүү жана жалган оң натыйжалар.

2.Аныктоо көп убакытты талап кылат жана операция түйшүктүү.

3.Тек сапаттык сыноо жүргүзүлүшү мүмкүн

Экинчи муундагы реалдуу убакыт ПТР

Real-Time PCR, ошондой эле qPCR катары белгилүү, реакция системасынын жүрүшүн көрсөтө турган флуоресценттүү зонддорду колдонот жана флуоресценттик сигналдардын топтолушу аркылуу күчөтүлгөн продуктулардын топтолушун көзөмөлдөйт жана флуоресценттик ийри сызык аркылуу жыйынтыктарды соттойт.Аны Cq маанисинин жана стандарттык ийри сызыгынын жардамы менен аныктоого болот.

qPCR технологиясы жабык системада ишке ашырылгандыктан, булгануу ыктымалдыгы азаят жана флуоресценттик сигнал сандык аныктоо үчүн көзөмөлдөнүшү мүмкүн, ошондуктан ал клиникалык практикада эң кеңири колдонулат жана ПТРде басымдуу технология болуп калды.

реалдуу убакыт флуоресценттик сандык ПТРде колдонулган флуоресценттик заттарды төмөнкүчө бөлүүгө болот: TaqMan флуоресценттик зонду, молекулярдык маяктар жана флуоресценттик боёк.

1) TaqMan флуоресценттик зонд:

ПТР күчөтүү учурунда, бир жуп праймерди кошуп жатканда, белгилүү бир флуоресценттик зонд кошулат.Зонд олигонуклеотид болуп саналат жана эки учу кабарчы флуоресценттик топ жана өчүрүүчү флуоресценттик топ менен белгиленет.

Зонд бүтүн болгондо, кабарчылар тобу чыгарган флуоресценттик сигналды өчүрүү тобу сиңирет;ПТР күчөтүү учурунда, Taq ферментинин 5′-3′ экзонуклеаза активдүүлүгү зондду бөлүп, начарлатат, бул флуоресценттик топтун флуоресценттик тобун ажыратат, ошентип флуоресценттик мониторинг системасы флуоресценттик сигналды кабыл алат, б.а. сигнал ПТР продуктунун пайда болушу менен толугу менен синхрондоштурулган.

2) SYBR флуоресценттик боёк:

ПЦР реакция системасында ашыкча SYBR флуоресценттик боёк кошулат.SYBR флуоресценттик боёгу спецификалык эмес ДНКнын кош тизмегине киргизилгенден кийин, ал флуоресценттик сигналды чыгарат.Чынжырга кирбеген SYBR боёк молекуласы флуоресценттик сигналды чыгарбайт, ошентип флуоресценттик сигналды камсыздайт. ПТР продуктуларынын көбөйүшү ПТР продуктуларынын көбөйүшү менен толугу менен синхрондоштурулган.SYBR эки саптуу ДНК менен гана байланышат, ошондуктан эрүү ийри сызыгы ПТР реакциясынын өзгөчөлүгүн аныктоо үчүн колдонулушу мүмкүн.

3) Молекулярдык маяк:

Бул 5 жана 3 учунда болжол менен 8 негиздерден турган чач кычкач түзүлүшүн түзгөн өзөк-улак кош белгиси бар олигонуклеотиддик зонд.Нуклеиндик кислотанын эки учундагы тизмеги толуктап жупташып, флуоресценттик топ менен өчүрүүчү топтун тыгыз болушун шарттайт.Жабуу, флуоресцент пайда болбойт.

ПТР продуктусу түзүлгөндөн кийин, күйгүзүү процессинде молекулярдык маяктын ортоңку бөлүгү белгилүү ДНК ырааттуулугу менен жупталат жана флуоресценттик ген флуоресценцияны өндүрүү үчүн өчүрүүчү генден бөлүнөт.

Экинчи муундагы ПТРдин негизги кемчиликтери:

Сезимталдуулук дагы эле жок, аз нускадагы үлгүлөрдү аныктоо так эмес.

Фондук маанинин таасири бар, натыйжасы кийлигишүүгө дуушар болот.

Реакция системасында ПТР ингибиторлору болгондо, аныктоонун натыйжалары кийлигишүүгө дуушар болот.

Үчүнчү муундагы санариптик ПТР

Санарип ПТР (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) акыркы чекиттик аныктоо аркылуу максаттуу катардын көчүрмөсүн эсептейт жана ички контролдорду жана стандарттык ийри сызыктарды колдонбостон так абсолюттук сандык аныктоону жүргүзө алат.

Санарип ПТР акыркы чекитти аныктоону колдонот жана Ct маанисинен (цикл босогосу) көз каранды эмес, ошондуктан санариптик ПТР реакциясы күчөтүү эффективдүүлүгүнө азыраак таасир этет, ал эми ПТР реакциясынын ингибиторлоруна толеранттуулук жакшыртылып, жогорку тактык жана кайталануучулук.

Жогорку сезгичтиктин жана жогорку тактыктын өзгөчөлүктөрүнөн улам, ага ПЦР реакциясынын ингибиторлору оңой кийлигишпейт жана стандарттуу продуктуларсыз чыныгы абсолюттук сандык аныктоого жетише алат, бул изилдөө жана колдонуу түйүнү болуп калды.

Реакция бирдигинин ар кандай формалары боюнча аны үч негизги түргө бөлүүгө болот: микрофлюиддик, чиптик жана тамчы системалары.

1) Микрофлюиддик санариптик ПТР, mdPCR:

Микрофлюиддик технологиянын негизинде ДНК шаблону бөлүнөт.Микрофлюиддик технология үлгүнүн нано-жаңылоосун же кичине тамчылардын генерациясын ишке ашыра алат, бирок тамчыларга атайын адсорбция ыкмасы керек, андан кийин ПТР реакция системасы менен айкалышат.mdPCR акырындык менен алмаштырылган башка ыкмалар менен кабыл алынган.

2) Тамчы негизиндеги санариптик ПТР, ddPCR:

Үлгүнү тамчыларга иштетүү үчүн майдагы суу тамчыларын түзүү технологиясын колдонуңуз жана нуклеин кислотасынын молекулаларын камтыган реакция системасын миңдеген наносөлчөмдүү тамчыларга бөлүңүз, алардын ар бири нуклеин кислотасынын максаттуу молекуласын камтыбайт, же текшерилүүчү бирден бир нече нуклеин кислотасынын максаттуу молекулаларын камтыйт.

3) Чипке негизделген санариптик ПТР, cdPCR:

Кремний пластинкаларына же кварц айнегине көптөгөн микротюбдерди жана микрокуңдуктарды чегип түшүрүү үчүн интегралдык суюктук жолунун технологиясын колдонуңуз жана ар кандай контролдук клапандар аркылуу эритменин агымын көзөмөлдөңүз жана абсолюттук сандык аныктоого жетишүү үчүн үлгү суюктугун бирдей өлчөмдөгү нанометрлерге бөлүңүз.

Үчүнчү муундагы ПТРдин негизги кемчиликтери:

Жабдуулар жана реагенттер кымбат.

Калыптын сапатына талаптар жогору.Эгерде калыптын саны микросистеманын өлчөмүнөн ашып кетсе, анын санын аныктоо мүмкүн эмес, ал эми өтө аз болсо, сандык тактык төмөндөйт.

Жалган позитивдер спецификалык эмес күчөтүү болгондо да пайда болушу мүмкүн.