Баары qRT-PCR экспериментинин принциби, праймердин дизайны, натыйжаларды интерпретациялоо ж.Бул кичинекей, бирок натыйжалар жөнүндө.
qRT-PCR жасоодон мурун, биз өзүбүздүн РНК жана операция ыкмаларын так түшүнүшүбүз керек.Анткени, биздин аракетибиз жөн эле машыгууга эмес, жыйынтык чыгарууга багытталган.Ошентип, qRT-PCR жасоодон мурун, биз төмөнкү маселелерди аныкташыбыз керек (алардын айрымдары SYBR үчүн гана колдонулат).
1 Сиздин РНК бузулбаганына ишенесизби?
NanoDrop 2000 РНКнын концентрациясын жана тазалыгын гана аныктай алат, бирок РНКнын бүтүндүгүн аныктай албайт.
РНК (РНКнын Intesity Number) мааниси Agilent 2100 Bioanalyzer системасы тарабынан аныкталган РНКнын бүтүндүгүн чагылдыра алат.
Сүрөт. Ар кандай РНК үлгүлөрү (эукариоттор) үчүн RIN маанилеринин схемалык диаграммасы
Бирок лабораторияларда көбүнчө Agilent 2100 биоанализер жок.Бул учурда формальдегид гели аркылуу аныктай алабыз, бирок РНКнын жалпы көлөмүнө болгон талап жогору, ошондуктан эң ылдам ыкма – кадимки гель электрофорезин колдонуу.Ал нуклеазасыз чөйрөдө болушу талап кылынат, ошондуктан электрофорез цистернасын, эритме бөтөлкөнү, гель кронштейнди жана DEPC суусу менен таракты чайкоо керек.Агароза да нуклеазасыз (ал жаңы ачылганда) жана жүктөө буферин 1,2% гел менен мүмкүн болушунча жаңы ачуу керек.
Гель толугу менен эритүү керек экенин эске алыңыз, антпесе ал сүрөттөгү 9-үлгүдө көрсөтүлгөндөй, бир тектүү эмес тилкелерди пайда кылат.Эгерде чыңалуу өтө жогору болсо же өтө көп убакытка иштесе, жылуулукту жаратып, РНКнын деградациясын пайда кылат, андыктан чыңалуу менен убакытты акылга сыярлык көзөмөлдөө керек.Мындан тышкары, гелди иштетүү үлгүдө ДНК калдыктары бар-жоктугун дагы аныктай алат жана бөлүштүрүүчү кудукта көп сандагы кармалып калган тилкелердин бар же жок экенин байкай алат.
Сүрөт.РНКнын гелдик электрофорезди аныктоо
2 cDNAңыздын концентрациясына ишенесизби?
Лабораториядагы чоң бир туугандардын тажрыйбасы ар бир инверсиядан алынган 20 ul системасынын кДНКсы 20X түз суюлтулган, ал эми пост-доктордук эжелер 10X суюлтулган.Мен көбүнчө кырдаалга жараша болом.Ар бир адам айткан РНКнын сапаты ар башка болгондуктан, тескерилөө деңгээли да ар башка жана тескери технология туруктуу болбой калышы мүмкүн.
Ошентип, мен тескери cDNA алган сайын, мен аны адегенде болжол менен 3 жолу суюлтам, андан кийин RT-PCR үчүн үй чарба генин колдоном, циклдердин саны жалпысынан 25 циклди түзөт, конкреттүү концентрацияны аныктоо үчүн, анан акыркы суюлтуу факторун аныктайт.
3 Праймериңизди колдонуу оңой экенине ишенесизби?
Ал qRT-PCR эрүү ийри сызыгынан өтө алат, бирок бул дагы эле акчаны талап кылат.Көп акчасы жок лабораториялар үчүн, алар көп праймер алгандан кийин, кадимки RT-PCR аркылуу анын бир тилке экендигин жана праймерлердин өзгөчөлүгүн аныктай алышат.Эгерде лабораторияда акча жетишсиз болсо, бардык праймерлердин өзгөчөлүгүн эрүү ийри сызыгы аркылуу бир жолу аныктоого болот.
4 Эксперименттик шарттарыңыз ылайыктуу экенине ишенесизби?
SYBR күчтүү жарыктан корголушу керек, андыктан SYBR реагентин кошуп жатканда үстүнкү жарыкты өчүрүүгө аракет кылыңыз жана аны аягына чыгаруу үчүн күңүрт жарыкты колдонуу керек.
SYBR 4°Cде сактаңыз.Колдонуп жатканда, көбүктөнүп калбаш үчүн жакшылап аралаштыруу үчүн акырын өйдө жана ылдый төңкөрүп коюңуз жана катуу айланбаңыз.
Кээ бир жаш эже-сиңдилер үлгүлөрдү аралаштырып алуудан коркуп, ПТР тактасына белги тартууну жакшы көрүшөт, бул туура эмес.Сиздин маркерлериңиз флуоресценттик сигналдардын жыйындысына таасир этиши мүмкүн болгондуктан, мен көбүнчө төмөндө көрсөтүлгөндөй, эс тутумга жардам берүү үчүн өспүрүмдөргө эксперименталдык дептерлерди колдонууну сунуштайм.
Сүрөт.qRT-PCR үлгүсүн жүктөө диаграммасы
5 Сиз муну туура кылып жатканыңызга ишенесизби?
Кол кап кийип, кол кап кийип, колкап кийип, маанилүү нерселерди үч жолу айтууну унутпаңыз.
SYBR жарыктын таасирин азайтуу үчүн, мен жекече төмөндөгү сүрөттө көрсөтүлгөндөй, алгач шаблонду кошкум келет.Тажрыйбага ылайык, шаблондун бир аз өлчөмүн кошуу үлгү алууда каталарды жаратышы мүмкүн.Ошондуктан, шаблондун бир аз өлчөмүн кошуудан келип чыккан катаны азайтуу үчүн, мен, адатта, үлгүнү кайра эки эсеге көбөйтөм жана H2O2 кошулган көлөмүн азайтуу үчүн үлгүнү кошкондо эки эсеге көбөйтөм.
Сүрөт.qRT-PCR жүктөөнүн схемалык диаграммасы
Андан кийин qRT-PCR системасын төмөнкүдөй конфигурациялаңыз.
Сүрөт.qRT-PCR системасын даярдоо диаграммасы
ЭСКЕРТҮҮ: Конфигурациялоо процесси музда жасалышы керек.
Үлгүнү кошкондон кийин тунук пломбаны чаптаңыз.Колуңуз менен тунук пломбанын бетине тийбөөгө аракет кылыңыз, жөн гана пленканын эки тарабындагы боштуктан иштетиңиз.Анткени манжа издери да флуоресценттик сигналдарды чогултууга таасирин тийгизиши мүмкүн.Андан кийин үлгү дубалга илинип калбашы үчүн центрифуганы 10 секундга төмөн ылдамдыкта тез центрифугалоо үчүн колдонуңуз.
Тектеш продуктылар:
Посттун убактысы: 28-апрель-2023
