一、реакция системасынын сезгичтигин жогорулатуу:

1. Жогорку сапаттагы РНКны изоляциялоо:

Ийгиликтүү cDNA синтези жогорку сапаттагы РНКдан келет.Жогорку сапаттагы РНК, жок эле дегенде, толук узундугу жана EDTA же SDS сыяктуу тескери транскриптаза ингибиторлору жок болушу керек.РНКнын сапаты cDNAга транскрипциялоо мүмкүн болгон ырааттуулук маалыматынын максималдуу көлөмүн аныктайт.Жалпы РНК тазалоо ыкмасы гуанидин изотиоцианат/фенол кислотасын колдонуу менен бир кадамдуу ыкма болуп саналат.RNase аз өлчөмдөгү булганууну болтурбоо үчүн, RNase-бай үлгүлөрдөн (мисалы, уйку бези) обочолонгон РНКны жогорку сапаттагы РНКны сактоо үчүн формальдегидде сактоо керек, өзгөчө узак мөөнөттүү сактоо үчүн.Чычкандын боорунан алынган РНК бир жума бою сууда сакталгандан кийин бузулган, ал эми келемиш көк боорунан алынган РНК 3 жыл сууда сакталгандан кийин туруктуу бойдон калган.Мындан тышкары, узундугу 4 кбдан ашкан транскрипттер майда транскрипттерге караганда изи RNases деградациясына көбүрөөк сезгич болушат.Сакталган РНК үлгүлөрүнүн туруктуулугун жогорулатуу үчүн РНКны деионизацияланган формамидде эритип, -70°Cде сактоого болот.РНКны сактоо үчүн колдонулган формамид РНКны бузуучу калдыктардан таза болушу керек.Уйку безинен РНК формамидде жок дегенде бир жыл сакталышы мүмкүн.РНКны колдонууга даярданып жатканда РНКны тунатуу үчүн төмөнкү ыкманы колдонсо болот: 0,2М жана этанолдун көлөмүнөн 4 эсе көп NaCl кошуп, бөлмө температурасында 3-5 мүнөткө коюп, 10000×г 5 мүнөттө центрифугалоо.

2. RNaseH-аракетсиз (RNaseH-) тескери транскриптазаны колдонуңуз:

RNase ингибиторлору кДНК синтезинин узундугун жана түшүмдүүлүгүн жогорулатуу үчүн көбүнчө тескери транскрипция реакцияларына кошулат.RNase ингибиторлору буфердин жана редукциялоочу агенттин (мисалы, DTT сыяктуу) катышуусунда биринчи катардагы синтез реакциясы учурунда кошулушу керек, анткени cDNA синтезине чейинки процесс ингибиторду денатурациялайт, ошону менен РНКны деградациялай турган байланышкан РНазаны бошотот.Протеин RNase ингибиторлору РНКнын A, B, C RNase деградациясын гана алдын алат жана RNase териге тоскоол болбойт, андыктан бул ингибиторлорду колдонууга карабастан, манжаларыңыздан RNase киргизүүдөн сак болуңуз.

Тескери транскриптаза РНКнын кДНКга айланышын катализдейт.M-MLV жана AMV экөө тең өздөрүнүн полимераздык активдүүлүгүнөн тышкары эндогендик RNaseH активдүүлүгүнө ээ.RNaseH активдүүлүгү жана полимераздык активдүүлүк РНК шаблону менен ДНК праймери же кДНК узартуу тилкесинин ортосунда пайда болгон гибриддик тилке үчүн бири-бири менен атаандашып, РНК:ДНК комплексиндеги РНК тилкесин начарлатат.RNaseH активдүүлүгү менен бузулган РНК шаблону кДНК синтези үчүн эффективдүү субстрат катары кызмат кыла албайт, бул кДНК синтезинин түшүмүн жана узундугун азайтат.Ошондуктан, бул жоюу же абдан тескери транскриптаза RNaseH ишин азайтуу үчүн пайдалуу болмок.

SuperScript Ⅱ тескери транскриптаза, RNaseH- MMLV тескери транскриптаза жана термоскрипт тескери транскриптаза, RNaseH- AMV, MMLV жана AMVге караганда көбүрөөк көлөмдө жана толук узундуктагы cDNA ала алат.RT-PCR сезгичтиги cDNA синтезинин көлөмүнөн таасир этет.ThermoScript AMVге караганда бир топ сезгич.RT-PCR продуктуларынын өлчөмү тескери транскриптазанын cDNAны синтездөө жөндөмдүүлүгү менен чектелет, айрыкча чоңураак cDNAларды клондоштурууда.MMLV менен салыштырганда, SuperScripⅡ узак RT-PCR өнүмдөрүнүн түшүмүн кыйла жогорулатты.RNaseH-кайтарым транскриптазасы да термостабилдүүлүктү жогорулатты, ошондуктан реакцияны нормалдуу 37-42°Cден жогору температурада жүргүзүүгө болот.Сунушталган синтез шарттарында oligo(dT) праймерди жана [α-P]dCTP 10 μCi колдонуңуз.Биринчи катардын жалпы түшүмдүүлүгү TCA жаадыргыч ыкмасы менен эсептелген.Толук узундуктагы cDNA өлчөмү боюнча сорттолгон тилкелерди колдонуу менен анализденди жана щелочтуу агароз гелинде саналды.

3. Тескери транскрипция үчүн инкубация температурасын көтөрүңүз:

Жогорку инкубация температурасы РНКнын экинчи структурасын ачууга жардам берип, реакциянын түшүмүн жогорулатат.Көпчүлүк РНК шаблондору үчүн РНКны жана праймерлерди буферсиз же тузсуз 65°C температурада инкубациялоо, андан кийин музда тез муздатуу көпчүлүк экинчи структураларды жок кылат жана праймерлерди байланыштырат.Бирок, кээ бир калыптар дагы эле жылуулук денатурациясы кийин да, экинчи структуралары бар.Бул татаал шаблондорду күчөтүү ThermoScript Reverse Transscriptase менен аткарылышы мүмкүн жана күчөтүүнү жакшыртуу үчүн тескери транскрипция реакциясын жогорку температурага коюу.Жогорку инкубация температурасы да өзгөчөлүктү жогорулатат, өзгөчө генге тиешелүү праймерлер (GSP) cDNA синтези үчүн колдонулганда (3-главаны караңыз).Эгерде GSP колдонулса, праймерлердин Tm күтүлгөн инкубация температурасы менен бирдей экендигин текшериңиз.Олиго(dT) жана туш келди праймерлерди 60°Cден жогору колдонбоңуз.Кокус праймерлер 60°Сге чейин жогорулаганга чейин 25°C температурада 10 мүнөт инкубациялоону талап кылат.Жогорку тескери транскрипция температурасын колдонуудан тышкары, өзгөчөлүктү РНК/праймер аралашмасын 65°C денатурация температурасынан тескери транскрипциянын инкубация температурасына түздөн-түз которуу жана алдын ала жылытылган 2× реакция аралашмасын (cDNA ысык баштоо синтези) кошуу аркылуу да жакшыртууга болот.Бул ыкма төмөнкү температурада пайда болгон молекулалар аралык базанын жупташуусунун алдын алууга жардам берет.RT-PCR үчүн талап кылынган бир нече температураны которуу термикалык циклди колдонуу менен жөнөкөйлөштүрүлүшү мүмкүн.

Tth термостабилдүү полимераз Mg2+ катышуусунда ДНК полимераза жана Mn2+ катышуусунда РНК полимераза ролун аткарат.Аны максималдуу 65°С температурада жылуу кармоого болот.Бирок, ПТР учурунда Mn2+ болушу ишенимдүүлүктү төмөндөтөт, бул Tth полимеразаны cDNAны клондоштуруу сыяктуу жогорку тактыктагы күчөтүү үчүн анча ылайыктуу эмес кылат.Мындан тышкары, Tth тескери транскрипциянын эффективдүүлүгү төмөн, бул сезгичтикти төмөндөтөт жана тескери транскрипция жана ПТР бир фермент менен жүргүзүлүшү мүмкүн болгондуктан, тескери транскрипциясы жок башкаруу реакциялары кДНКны күчөтүү продуктуларын булганган геномдук ДНК менен салыштыруу үчүн колдонулушу мүмкүн эмес.күчөтүү продуктылары бөлүнгөн.

4. Тескери транскрипцияга көмөктөшүүчү кошумчалар:

Кошумчалар, анын ичинде глицерин жана DMSO биринчи катардагы синтез реакциясына кошулат, алар нуклеин кислотасынын кош тизмегинин туруктуулугун төмөндөтөт жана РНКнын экинчилик структурасын чечет.20% га чейин глицерин же 10% DMSO SuperScript II же MMLV активдүүлүгүнө таасирин тийгизбестен кошулса болот.AMV ошондой эле активдүүлүгүн жоготпостон 20% глицеролду көтөрө алат.SuperScriptⅡ тескери транскрипция реакциясында RT-PCRдин сезгичтигин жогорулатуу үчүн 10% глицерин кошуп, 45°Cде инкубациялоого болот.Эгерде ПТРге тескери транскрипция реакциясынын продуктусунун 1/10 бөлүгү кошулса, анда күчөтүү реакциясында глицериндин концентрациясы 0,4% түзөт, бул ПТРди бөгөт коюу үчүн жетишсиз.

5. RNaseH дарылоо:

PCR чейин RNaseH менен cDNA синтези реакцияларын дарылоо сезимталдыкты жогорулатат.Кээ бир калыптар үчүн, cDNA синтези реакциясындагы РНК күчөтүү продуктуларынын байланышына жол бербейт деп ойлошот, бул учурда RNaseH менен дарылоо сезгичтикти жогорулатат.Жалпысынан алганда, RNaseH дарылоо, мисалы, аз нуска тубероздук скероз II сыяктуу узунураак толук узундуктагы cDNA максаттуу шаблондорун күчөтүүдө зарыл.Бул татаал шаблон үчүн RNaseH дарылоо SuperScript II же AMV синтезделген cDNA тарабынан өндүрүлгөн сигналды күчөттү.Көпчүлүк RT-PCR реакциялары үчүн RNaseH менен дарылоо милдеттүү эмес, анткени 95°C ПТР денатурация кадамы жалпысынан РНК:ДНК комплексиндеги РНКны гидролиздейт.

6. Чакан РНКны аныктоо ыкмасын жакшыртуу:

RT-ПЦР РНКнын аз гана өлчөмдөгү бар болгондо өзгөчө кыйынга турат.РНК обочолонуу учурунда ташуучу катары кошулган гликоген кичинекей үлгүлөрдүн түшүмүн жогорулатууга жардам берет.RNase-эркин гликоген Trizol кошуу менен бир эле учурда кошууга болот.Гликоген сууда эрийт жана кийинки жаан-чачынга жардам берүү үчүн РНК менен суу фазасында сакталышы мүмкүн.50 мг кыртыш же 106 өстүрүлгөн клеткалардан аз үлгүлөр үчүн RNase-эркин гликогендин сунушталган концентрациясы 250 мкг/мл.

SuperScript II аркылуу тескери транскрипция реакциясына ацетилденген BSA кошуу сезгичтикти жогорулатат, ал эми РНКнын аз өлчөмдөрү үчүн SuperScript II көлөмүн азайтуу жана RNaseOut нуклеаза ингибиторунун 40 бирдигин кошуу аныктоо деңгээлин жогорулатат.Эгерде гликоген РНКны изоляциялоо процессинде колдонулса, тескери транскрипция реакциясы үчүн SuperScript II колдонууда BSA же RNase ингибиторун кошуу сунушталат.

二、RT-PCR өзгөчөлүгүн жогорулатуу

1. CND асинтези:

Биринчи катардагы кДНК синтезин үч түрдүү ыкма менен баштоого болот, алардын салыштырмалуу өзгөчөлүгү синтезделген кДНКнын көлөмүнө жана түрүнө таасир этет.

Кокус праймер ыкмасы үч ыкманын эң аз өзгөчөлүгү болгон.Праймерлер транскрипт боюнча бир нече сайттарда эритип, кыска, жарым-жартылай узундуктагы кДНКларды түзүшөт.Бул ыкма көбүнчө 5′ соңку ырааттуулугун алуу үчүн жана экинчилик түзүлүштөгү аймактары бар же тескери транскриптаза менен репликацияланбай турган токтотуу участоктору бар РНК шаблондорунан cDNA алуу үчүн колдонулат.Эң узун кДНКны алуу үчүн ар бир РНК үлгүсүндөгү праймерлердин РНКга болгон катышын эмпирикалык түрдө аныктоо керек.Кокус праймерлердин баштапкы концентрациясы 20 мкл реакцияга 50дөн 250 нгга чейин өзгөрдү.Кокус праймерлер аркылуу жалпы РНКдан синтезделген кДНК биринчи кезекте рибосомалык РНК болгондуктан, көбүнчө калып катары поли(А)+РНК тандалат.

Oligo(dT) праймерлери туш келди праймерлерге караганда өзгөчө.Көпчүлүк эукариоттук мРНКлардын 3′ учунда жайгашкан поли(А) куйругу менен гибриддешет.Поли(А)+ РНК жалпы РНКнын болжол менен 1%дан 2%ке чейинкисин түзгөндүктөн, cDNAнын саны жана татаалдыгы кокус праймерлерге караганда бир топ азыраак.Өзүнүн жогорку өзгөчөлүгүнөн улам, олиго(dT) көбүнчө РНКнын праймерлер менен катышын оптималдаштырууну жана поли(А)+ тандоону талап кылбайт.Бул 20μl реакция системасына 0.5μg олиго (дТ) колдонуу сунуш кылынат.oligo(dT)12-18 көпчүлүк RT-PCR үчүн ылайыктуу.ThermoScript RT-PCR системасы алиго(dT)20ну сунуштайт, анткени анын жогорку инкубация температуралары үчүн жакшы жылуулук туруктуулугу бар.

Генге мүнөздүү праймерлер (GSP) тескери транскрипция кадамы үчүн эң спецификалык праймерлер.GSP бардык РНКларга кошулган кокус праймерлерден же олигодон (dT) айырмаланып, РНКнын максаттуу ырааттуулугуна гибриддештире алган антисенстик олигонуклеотид.ПТР праймерлерин долбоорлоодо колдонулган ошол эле эрежелер тескери транскрипция реакцияларында GSP долбооруна колдонулат.GSP mRNAнын 3′-эң аягына чейин күйгүзүүчү күчөтүүчү праймер менен бирдей ырааттуулукта болушу мүмкүн, же GSP тескери күчөтүү праймеринин ылдый жагындагы агым үчүн иштелип чыгышы мүмкүн.Кээ бир күчөтүлгөн субъекттер үчүн ийгиликтүү RT-PCR үчүн бирден ашык антисенстик праймер иштелип чыгышы керек, анткени максаттуу РНКнын экинчилик структурасы праймердин туташуусуна тоскоол болушу мүмкүн.Бул 20 мкл биринчи катар синтез реакция 1 pmol антисенс GSP колдонуу сунуш кылынат.

2. Тескери транскрипция үчүн инкубация температурасын көтөрүңүз:

GSP спецификасынын толук артыкчылыгын толук пайдалануу үчүн, термостабилдүүлүгү жогору болгон тескери транскриптазаны колдонуу керек.Термостабилдүү тескери транскриптазаларды реакциянын катуулугун жогорулатуу үчүн жогорку температурада инкубациялоого болот.Мисалы, эгерде GSP 55°C температурада жашылса, анда AMV же M-MLV тескери транскрипция үчүн 37°C төмөн катуулугунда колдонулса, GSPтин өзгөчөлүгү толук пайдаланылбайт.Бирок, SuperScript II жана ThermoScript 50°C же андан жогорку температурада реакцияга кириши мүмкүн, бул төмөнкү температурада пайда болгон спецификалык эмес өнүмдөрдү жок кылат.Максималдуу өзгөчөлүк үчүн РНК/праймер аралашмасын 65°C денатурация температурасынан тескери транскрипциянын инкубация температурасына түздөн-түз которууга жана алдын ала жылытылган 2× реакция аралашмасына кошууга болот (кДНК синтезинин ысык башталышы).Бул төмөнкү температурада молекулалар аралык базанын жупташуусуна жол бербөөгө жардам берет.RT-PCR үчүн талап кылынган бир нече температуралык өтүүлөрдү термикалык циклдерди колдонуу менен жөнөкөйлөштүрсө болот.

3. Геномдук ДНКнын булганышын азайтат:

РНКдагы геномдук ДНКнын булганышы RT-PCR менен кездешүүчү мүмкүн болуучу кыйынчылык болуп саналат.Тризол реагент сыяктуу РНКны изоляциялоонун жакшы ыкмасын колдонуу РНК препаратын булгаган геномдук ДНКнын көлөмүн азайтат.Геномдук ДНКдан алынган өнүмдөрдү болтурбоо үчүн, РНКны кайра транскрипцияга чейин булгоочу ДНКны жок кылуу үчүн күчөтүү даражасындагы DNase I менен дарыласа болот.DNase I сиңирүү үлгүлөрдү 2,0 мм EDTAда 65°Cде 10 мүнөт инкубациялоо менен токтотулду.EDTA жогорку температурада магний ионуна көз каранды РНК гидролиз алдын алуу, магний иондорун chelate болот.

Күчөтүлгөн кДНКны булганган геномдук ДНКны күчөтүү продуктуларынан бөлүү үчүн, праймерлер ар бир экзонду бөлүп алуу үчүн иштелип чыгышы мүмкүн.cDNAдан алынган ПТР продуктулары булганган геномдук ДНКдан алынгандарга караганда кыскараак болот.Мындан тышкары, ар бир РНК шаблонунда тескери транскрипциясы жок контролдук эксперимент жүргүзүлгөн, бул фрагменттин геномдук ДНКдан же кДНКдан алынгандыгын аныктоо.Тескери транскрипциясыз алынган ПТР продуктусу геномдон алынат.