Ⅰ. Реакция системасынын сезгичтигин жогорулатуу:
1. Жогорку сапаттагы РНКны бөлүңүз:
Ийгиликтүү cDNA синтези жогорку сапаттагы РНКдан келет.Жогорку сапаттагы РНК, жок эле дегенде, жалпы узак убакытты камсыз кылууга тийиш жана EDTA же SDS сыяктуу жазуу ферменттерин камтыбаган ингибиторлорду камтыбайт.РНКнын сапаты сиз кДНКга көчүрө ала турган ырааттуулук маалыматынын максималдуу маанисин аныктайт.Жалпы РНК тазалоо ыкмасы isoocyanate/acidophenol колдонуу кадам ыкмасы болуп саналат.RNazдын булганышын алдын алуу үчүн, RNaseге бай үлгүдөн (мисалы, уйку бези) бөлүнгөн РНК жогорку сапаттагы РНКны сактоо үчүн формальдегидди сактоону талап кылат, бул андан да көп узак мөөнөттүү сактоо үчүн.Чычкандын боорунан алынган РНК сууда бир жума сакталгандан кийин бузулган, ал эми келемиш көк боорунан алынган РНК сууда үч жыл сакталгандан кийин туруктуу бойдон калган.Кошумчалай кетсек, 4кбдан чоңураак стенограммалар RNase деградациясынын изине кичине транскрипттерге караганда сезгич.Сактоочу РНК үлгүсүнүн туруктуулугун жогорулатуу үчүн РНК иондун метальмамининде эритүү мүмкүн жана -70 °C сакталат.РНКны сактоо үчүн колдонулган тилидде РНКны начарлатуучу ар кандай объект болбошу керек.Уйку безинен алынган РНКны метальминде кеминде бир жыл сактаса болот.РНКны колдонууга даяр болгондо, РНКны тунатуу үчүн төмөнкү ыкмаларды колдонсоңуз болот: NaCl 0,2м жана этанолдун 4 эсе көлөмүнө кошуп, бөлмө температурасында 3-5 мүнөткө жана 10000 × г центрифугада 5 мүнөткө.
2. RNaseH активдүүлүгү жок тескери транскриптазаны колдонуңуз (RNaseH-):
RNase ингибиторлору кДНК синтезинин узундугун жана түшүмдүүлүгүн жогорулатуу үчүн көбүнчө тескери транскрипция реакцияларына кошулат.RNase ингибитору биринчи чынжырлуу синтез реакциясында буферлердин жана DTT сыяктуу редукциялоочу агенттердин катышуусунда кошулат, анткени cDNAга чейинки синтез процесси ингибиторду денатурациялап, ошону менен РНКны деградациялоочу байланышкан РНазаларды бөлүп чыгарат.Протеин RNase ингибитору РНКнын A, B, C RNase деградациясын гана алдын алат жана териге RNase алдын албайт, ошондуктан бул ингибиторлорду колдонууга карабастан, манжалардан RNase киргизбөө үчүн кам көрүү керек.
Тескери транскриптаза РНКнын кДНКга айланышын катализдейт.M-MLV жана AMV экөө тең өздөрүнүн полимераздык активдүүлүгүнөн тышкары эндогендик RNaseH активдүүлүгүнө ээ.RNaseH активдүүлүгү РНК шаблондору жана ДНК праймерлери же cDNA узартуу тилкелери арасында пайда болгон гетерозиготалуу тилкелер үчүн полимераздык активдүүлүк менен атаандашып, РНКны: ДНК комплекстериндеги РНК тилкелерин бузат.RNaseH активдүүлүгү менен бузулган РНК шаблондору кДНК синтези үчүн эффективдүү субстрат катары колдонулушу мүмкүн эмес, бул кДНК синтезинин түшүмүн жана узундугун азайтат.Ошентип, тескери транскриптазанын RNaseH активдүүлүгүн жок кылуу же бир топ кыскартуу чоң пайда алып келет.
SuperScriptⅡ тескери транскриптаза, RNaseH-нин MMLV тескери транскриптазасы жана термоСкрипт тескери транскриптаза, RNaseH-тин AMV-сы MMLV жана AMVге караганда толук узундуктагы cDNAны берди.RT-PCR сезгичтиги синтезделген кДНКнын көлөмүнөн таасир этет.ThermoScript AMVге караганда бир топ сезгич.RT-PCR продуктуларынын көлөмү тескери транскриптазанын cDNAны синтездөө жөндөмдүүлүгү менен чектелет, өзгөчө чоңураак Cdnas клондоштурууда.MMLV менен салыштырганда, SuperScripⅡ узак RT-PCR өнүмдөрүнүн түшүмүн кыйла жогорулатты.RNaseH-тин тескери транскриптазасы да термикалык туруктуулукту жогорулатат, ошондуктан реакцияны нормадан 37-42℃ жогору температурада жүргүзүүгө болот.Сунушталган синтез шарттарында олиго(dT) праймерлер жана 10μCi [alpha-p] dCTP колдонулган.Биринчи чынжырдын жалпы өндүрүшү TCA жаан ыкмасы менен эсептелген.Толук узундуктагы cDNA өлчөмү боюнча сорттолгон тилкени алып салуу жана щелочтуу агароза гелинде эсептөө аркылуу талданды.
3. Тескери транскрипциянын жылуулукту сактоо температурасын жогорулатуу:
Жогорку кармап туруу температурасы РНКнын экинчилик структурасын ачууга жана реакциянын түшүмдүүлүгүн жогорулатууга жардам берет.Көпчүлүк РНК шаблондору үчүн РНКны жана праймерди буферсиз же тузсуз 65°C температурада кармап, анан музда тез муздатуу көпчүлүк экинчилик структураларды жок кылат жана праймерлердин туташуусуна мүмкүндүк берет.Бирок, кээ бир калыптар дагы эле жылуулук денатурациядан кийин, экинчи даражадагы түзүлүшкө ээ.Бул татаал калыптарды күчөтүү ThermoScript тескери транскриптазаны колдонуу менен жана күчөтүүнү жакшыртуу үчүн тескери транскриптаза реакциясын жогорку температурага коюу менен жүргүзүлүшү мүмкүн.Айрыкча cDNA синтези генге тиешелүү праймерлерди (GSPS) колдонуу менен аткарылганда жогорку кармап туруу температурасы да өзгөчөлүктү жогорулатат (3-главаны караңыз).Эгерде GSP колдонулса, праймердин Tm мааниси күтүлгөн кармап туруу температурасы менен бирдей экенин текшериңиз.Олиго(dT) жана 60℃ден жогору кокус праймерлерди колдонбоңуз.Кокус праймерлерди 60 ℃ чейин жогорулатуудан мурун 25℃ температурада 10 мүнөт кармап туруу керек.Тескери транскрипциянын жогорку температураларын колдонуудан тышкары, өзгөчөлүктү РНК/праймер аралашмасын 65℃ денатурациялоочу температурадан тескери транскрипцияны кармоо температурасына түздөн-түз которуу жана алдын ала ысытылган 2× реакция аралашмасын (кДНКнын термикалык инициация синтези) кошуу менен жакшыртса болот.Бул ыкма төмөнкү температурада пайда болгон молекулалар аралык базанын жупташуусунун алдын алууга жардам берет.ПТР инструментин колдонуу RT-PCR үчүн талап кылынган көптөгөн температура которгучтарын жөнөкөйлөтөт.
Tth жылуулук менен стабилдештирилген полимераза Mg2+ катышуусунда ДНК полимераза жана Mn2+ катышуусунда РНК полимераза ролун аткарат.Ал 65 ℃ чейин жылуулукту кармай алат.Бирок, ПТР учурунда Mn2+ болушу ишенимдүүлүктү азайтат, бул Tth полимеразаны cDNA клондоо сыяктуу жогорку тактыктагы күчөтүү үчүн анча ылайыктуу эмес кылат.Мындан тышкары, Tth тескери транскрипцияда азыраак эффективдүү, бул сезгичтикти төмөндөтөт жана бир фермент тескери транскрипцияны жана ПТРди аткара алгандыктан, тескери транскрипциясы жок башкаруу реакциялары кДНКнын күчөтүлгөн продуктуларын булганган геномдук ДНКдан айырмалоо үчүн колдонулушу мүмкүн эмес.
4. Тескери транскрипцияга көмөктөшүүчү кошумча:
Кошумчаларды, анын ичинде глицерин жана DMSO, биринчи чынжырлуу синтез реакциясына кошуу нуклеин кислотасынын кош тизмегинин туруктуулугун төмөндөтүп, РНКнын экинчилик структурасын чечиши мүмкүн.SuperScriptⅡ же MMLV активдүүлүгүнө таасирин тийгизбестен 20% глицерин же 10% DMSO кошулса болот.AMV ошондой эле активдүүлүктү азайтпастан 20% глицеролду көтөрө алат.SuperScriptⅡ тескери транскрипция реакциясында RT-PCRдин сезгичтигин жогорулатуу үчүн 10% глицерин кошуп, 45℃ температурада изоляциялоого болот.Эгерде ПТРге ретротранскрипция-реакция продуктунун 1/10 бөлүгү кошулса, күчөтүү реакциясында глицериндин концентрациясы 0,4% түзөт, бул ПТРди бөгөт коюу үчүн жетишсиз.
5. RNaseH иштетүү:
Сезгичтикти ПЦРге чейин RNaseH менен cDNA синтез реакцияларын дарылоо аркылуу жакшыртууга болот.Кээ бир калыптар үчүн, cDNA синтез реакциясындагы РНК күчөтүлгөн продуктулардын байланышына жол бербейт деп ойлошот, бул учурда RNaseH менен дарылоо сезимталдыкты жогорулатат.Жалпысынан алганда, RNaseH дарылоо салыштырмалуу узун толук узундуктагы cDNA максаттуу шаблонду, мисалы, тубероздук скерозⅡ аз көчүрмөсү менен күчөтүү үчүн талап кылынат.Бул татаал шаблон үчүн RNaseH SuperScriptⅡ же AMV тарабынан синтезделген cDNA тарабынан түзүлгөн сигналды күчөттү.Көпчүлүк RT-PCR реакциялары үчүн RNaseH менен дарылоо милдеттүү эмес, анткени 95℃ изоляцияланган ПТР денатурация кадамы адатта РНКдан РНКны гидролиздейт: ДНК комплекси.
6. Аз өлчөмдөгү РНКны аныктоонун жакшыртылган ыкмалары:
RT-ПЦР РНКнын аз гана өлчөмдөгү бар болгондо өзгөчө кыйынга турат.РНК бөлүү учурунда алып жүрүүчү катары гликогендин кошулушу кичинекей үлгүлөрдүн түшүмүн жогорулатууга жардам берет.Trizol менен бир эле учурда RNase-эркин гликоген кошулса болот.Гликоген сууда эрүүчү жана кийинки жаан-чачынга жардам берүү үчүн РНК менен суу фазасында кала алат.RNase-эркин гликогендин сунушталган концентрациясы 50 мг кыртыштын же 106 өстүрүлгөн клетканын үлгүлөрү үчүн 250μг/мл.
SuperScriptⅡ аркылуу тескери транскрипция реакцияларына ацетилденген BSA кошуу сезгичтикти жогорулатат, ал эми РНКнын аз өлчөмдөрү үчүн SuperScriptⅡ санын азайтып, RnaseOut нуклеаза ингибиторунун 40 бирдигин кошуу аныктоо деңгээлин жакшыртат.Эгерде гликоген РНКны бөлүүдө колдонулса, SuperScriptⅡ жардамы менен кайра транскрипциялоо реакцияларына BSA же RNase ингибиторлорун кошуу дагы эле сунушталат.
Ⅱ. RT-PCR өзгөчөлүгүн жогорулатуу
1. cNDA синтези:
Биринчи катардагы cDNA синтезин баштоо үчүн үч түрдүү ыкманы колдонсо болот жана ар бир ыкманын салыштырмалуу өзгөчөлүгү синтезделген кДНКнын көлөмүнө жана түрүнө таасир этет.
Кокус праймер ыкмасы үч ыкманын эң аз өзгөчөлүгү болуп саналат.Праймерлер кыска, жарым-жартылай узундуктагы кДНКны өндүрүү үчүн транскрипт боюнча бир нече жерлерде күйдүрүлөт.Бул ыкма көбүнчө экинчи структуралык аймактары бар же тескери транскриптаза репликациялай албаган аяктоочу сайттары бар РНК шаблондорунан 5′ терминалдык тизмектерди жана cDNA алуу үчүн колдонулат.Эң узун кДНКны алуу үчүн ар бир РНК үлгүсүндөгү праймерлердин РНКга болгон катышын эмпирикалык түрдө аныктоо керек.Кокус праймерлердин баштапкы концентрациясы 20μl реакция системасына 50дөн 250нгге чейин.Кокус праймерлер аркылуу жалпы РНКдан синтезделген кДНК негизинен рибосомалык РНК болгондуктан, көбүнчө шаблон катары поли(А)+РНК тандалат.
Oligo(dT) инициациясы туш келди праймерлерге караганда өзгөчө.Көпчүлүк эукариоттук клеткаларда мРНКнын 3′ учунда жайгашкан поли(А) куйругу менен гибриддешет.Поли(А)+РНК жалпы РНКнын болжол менен 1%дан 2%ке чейинкисин түзгөндүктөн, cDNAнын көлөмү жана татаалдыгы кокус праймерлер колдонулгандан алда канча азыраак.Өзүнүн жогорку өзгөчөлүгүнөн улам, олиго(dT) көбүнчө РНКнын праймердин катышына оптималдаштырууну жана поли(А)+ тандоону талап кылбайт.Бул 20μl реакция системасына 0.5μg олиго (дТ) колдонуу сунуш кылынат.oligo(dT)12-18 көпчүлүк RT-PCR үчүн ылайыктуу.ThermoScript RT-PCR системасы жакшы термикалык туруктуулугунан улам олиго(dT)20 менен камсыз кылат жана жогорку кармоо температураларына ылайыктуу.
Гене-спецификалык праймерлер (GSP) тескери транскрипция кадамы үчүн эң жакшы спецификалык праймерлер.GSP - бул антисенстик олигонуклеозид, ал РНКнын көздөгөн тизмеги менен гибриддештире алат, тескерисинче, туш келди праймерлер же олиго (dT) сыяктуу бардык Рналарды жууп салбастан.ПТР праймерлерин долбоорлоодо колдонулган эрежелер GSP тескери транскрипция реакциясынын дизайнына да тиешелүү.GSP mRNA3' аягында күйдүрүлгөн күчөтүүчү праймер менен бирдей ырааттуулукта болушу мүмкүн же GSP тескери күчөтүү праймери менен ылдыйкы агымда күйдүрүү үчүн иштелип чыгышы мүмкүн.Кээ бир күчөтүлгөн объекттер үчүн ийгиликтүү RT-PCR үчүн бирден ашык антисенстик праймерди долбоорлоо зарыл, анткени максаттуу РНКнын экинчилик структурасы праймердин туташуусуна тоскоол болушу мүмкүн.Бул 20μl биринчи чынжыр синтез реакция системасында 1pmol антисенс GSP колдонуу сунуш кылынат.
2. Тескери транскрипциянын жылуулукту сактоо температурасын жогорулатуу:
GSP өзгөчөлүгүн толук пайдалануу үчүн, жогорку жылуулук туруктуулугу менен тескери транскриптаза колдонулушу керек.Жылуулукка туруктуу тескери транскриптаза реакциянын катуулугун жогорулатуу үчүн жогорку температурада изоляцияланышы мүмкүн.Мисалы, эгерде GSP 55°C температурада күйгүзүлсө, анда AMV же M-MLV аркылуу 37°C тескери транскрипция төмөн катуулук менен аткарылса, GSP өзгөчөлүгү толук пайдаланылбайт.Бирок, SuperScripⅡ жана ThermoScript 50℃ же андан жогору реакция жасай алат, бул төмөнкү температурада өндүрүлгөн спецификалык эмес өнүмдөрдү жок кылат.Максималдуу өзгөчөлүк үчүн РНК/праймер аралашмасы 65℃ денатурация температурасынан алдын ала ысытылган 2 х реакция аралашмасын (кДНК синтезинин термикалык башталышы) кошуу менен тескери транскрипцияны кармоочу температурага түз өткөрүлүшү мүмкүн.Бул төмөнкү температурада молекулалар ортосундагы базалык жупташууну алдын алууга жардам берет.ПТР аспапты колдонуу RT-PCR үчүн талап кылынган көптөгөн температуралык өтүүлөрдү жөнөкөйлөтөт.
3. Геномдук ДНКнын булганышын азайтыңыз:
RT-PCR менен мүмкүн болгон кыйынчылыктардын бири РНК геномдук ДНКны булгайт.Trizol Reagent сыяктуу жакшыраак РНК бөлүү ыкмаларын колдонуу РНК препараттарында геномдук ДНКнын булганышын азайтат.Геномдук ДНКдан өндүрүлгөн өнүмдөрдү болтурбоо үчүн, РНКны тескери транскрипцияга чейин булганган ДНКны алып салуу үчүн DnasⅠ күчөтүү даражасы менен дарылоого болот.Үлгүлөр DNaseⅠ сиңирүүнү токтотуу үчүн 2,0 мм EDTAда 65 ℃ температурада 10 мүнөт сакталды.EDTA жогорку температурада пайда болгон магний ионуна көз каранды РНК гидролизинин алдын алуу үчүн магний иондорун хелаттайт.
Кеңейтилген кДНКны геномдун ДНКны күчөтүү продуктусунан бөлүү үчүн бөлүнгөн экзон менен өзүнчө күйгүзүүчү праймерлер жасалышы мүмкүн.cDNAдан алынган ПТР продуктулары булганган геномдук ДНКдан алынгандарга караганда кыскараак болот.Берилген фрагмент геномдук ДНКдан же кДНКдан экендигин аныктоо үчүн ар бир РНК шаблонунда тескери транскрипциясы жок башкарылуучу эксперимент жүргүзүлөт.Тескери транскрипция болбогондо алынган ПТР продуктулары геномдон алынат.
Тектеш продукт
-Бир кадамдуу комплект тескери транскрипцияны жана ПТРди бир түтүктө жүргүзүүгө мүмкүндүк берет.Ал бир гана шаблон РНК, конкреттүү ПТР праймерлер жана RNase-Free ddH кошуу керек2O.
-РНКнын реалдуу убакытта сандык анализи тез жана так жүргүзүлүшү мүмкүн.
-Комплект реакциянын күчөтүү эффективдүүлүгүн жана өзгөчөлүгүн эффективдүү жакшыртуу үчүн уникалдуу реакция системасы менен айкалышкан Foregene тескери транскрипциялоочу уникалдуу реагентти жана Foregene HotStar Taq ДНК Полимеразасын колдонот.
- Оптимизацияланган реакция системасы реакциянын жогорку сезгичтүүлүгүнө, күчтүү термикалык туруктуулугуна жана жакшы сабырдуулукка ээ кылат.
-2 мүнөттүн ичинде шаблондогу гДНКны жок кыла турган гДНКны жок кылуунун эффективдүү мүмкүнчүлүгү.
- Эффективдүү тескери транскрипция системасы, cDNAнын биринчи тилкесинин синтезин аяктоо үчүн болгону 15 мүнөт талап кылынат.
-Татаал шаблондор: жогорку GC мазмуну жана татаал экинчи структурасы бар шаблондор да жогорку эффективдүүлүк менен артка кайтарылышы мүмкүн.
-Жогорку сезгичтиктеги тескери транскрипция системасы, pg деңгээлиндеги шаблондор да жогорку сапаттагы cDNA ала алат.
-Тескери транскрипция системасы жогорку жылуулук туруктуулугуна ээ, оптималдуу реакция температурасы 42 ℃ жана ал дагы эле 50 ℃ тескери транскрипциянын жакшы көрсөткүчүнө ээ.
Посттун убактысы: Мар-07-2023
