1. Негизги билим (эгер сиз эксперименталдык бөлүгүн көргүңүз келсе, түздөн-түз экинчи бөлүккө өтүңүз)
Кадимки ПТРдин туунду реакциясы катары, реалдуу убакыт ПТР негизинен флуоресценттик сигналдын өзгөрүшү аркылуу реалдуу убакытта ПТР күчөтүү реакциясынын ар бир циклинде күчөтүү продуктунун көлөмүнүн өзгөрүшүн көзөмөлдөйт жана ct мааниси менен стандарттык ийри сызыктын ортосундагы байланыш аркылуу баштапкы шаблонду сандык жактан талдайт.
RT-PCR конкреттүү маалыматтар болуп саналатбазалык, флуоресценттик босогожанаCt мааниси.
| негизги: | 3-15-циклдын флуоресценттик мааниси базалык (базалык) болуп саналат, ал өлчөөнүн маал-маалы менен катасынан келип чыгат. |
| Босого (босого): | Күчөтүү ийри сызыгынын экспоненциалдык өсүү аймагындагы тиешелүү позицияда коюлган флуоресценцияны аныктоо чегине тиешелүү, жалпысынан базалык сызыктын стандарттык четтөөсүнөн 10 эсе көп. |
| КТ мааниси: | Бул ар бир реакция түтүкчөсүндөгү флуоресценция мааниси босогого жеткенде ПТР циклдарынын саны. Ct мааниси баштапкы калыптын суммасына тескери пропорционалдуу. |
RT-PCR үчүн жалпы белгилөө ыкмалары:
| ыкмасы | артыкчылыгы | кемчилик | колдонуу чөйрөсү |
| SYBR GreenⅠ | Кеңири колдонуу, сезимтал, арзан жана ыңгайлуу | Праймердин талаптары жогору, спецификалык эмес тилкелерге жакын | Бул ар кандай максаттуу гендердин сандык анализи, гендердин экспрессиясын изилдөө жана трансгендик рекомбинантты жаныбарлар менен өсүмдүктөрдү изилдөө үчүн ылайыктуу. |
| TaqMan | Жакшы өзгөчөлүк жана жогорку кайталануучу | Баасы жогору жана конкреттүү максаттар үчүн гана ылайыктуу. | Патогенди аныктоо, дарыга туруктуулук генин изилдөө, дары-дармектин натыйжалуулугун баалоо, генетикалык оорулардын диагностикасы. |
| молекулярдык маяк | Жогорку өзгөчөлүк, флуоресценция, төмөн фон | Баасы кымбат, белгилүү бир максатка гана ылайыктуу, дизайны кыйын, баасы кымбат. | Өзгөчө ген анализи, SNP анализи |
2. Эксперименттик кадамдар
2.1 Эксперименталдык топтоо жөнүндө- группада бир нече скважина болушу керек жана биологиялык кайталоолор болушу керек.
| ① | Бош башкаруу | Эксперименттерде клетканын өсүү абалын аныктоо үчүн колдонулат |
| ② | Терс башкаруу siRNA (спецификалык эмес siRNA ырааттуулугу) | RNAi аракетинин өзгөчөлүгүн көрсөтүү.siRNA 200nM концентрациясында спецификалык эмес стресстик жоопту жаратышы мүмкүн. |
| ③ | Трансфекциялык реагентти көзөмөлдөө | Трансфекция реагентинин клеткаларга уулуулугун же максаттуу гендин экспрессиясына таасирин жокко чыгарбаңыз |
| ④ | siRNA максаттуу генге каршы | Максаттуу гендин экспрессиясын кыйратыңыз |
| ⑤ (милдеттүү эмес) | оң siRNA | Эксперименталдык системаны жана операциялык көйгөйлөрдү чечүү үчүн колдонулат |
| ⑥ (милдеттүү эмес) | Fluorescent башкаруу siRNA | Клетка трансфекциясынын эффективдүүлүгүн микроскоп менен байкоого болот |
2.2 Праймерди конструкциялоонун принциптери
| Кеңейтилген фрагменттин өлчөмү | Жакшыраак 100-150bp |
| Primer Length | 18-25б |
| GC мазмуну | 30%-70%, жакшыраак 45%-55% |
| Tm мааниси | 58-60℃ |
| Ырааттуулук | T/C үзгүлтүксүз болбоо;A/G үзгүлтүксүз |
| 3 аягы ырааттуулугу | GC бай же AT бай болбоңуз;терминалдык база артыкчылык G же C;Т |
| Толуктоочулук | Праймердин ичинде же эки праймердин ортосунда 3төн ашык негиздерди толуктоочу ырааттуулуктан качыңыз |
| Өзгөчөлүк | Праймердин өзгөчөлүгүн ырастоо үчүн жарылуу издөөнү колдонуңуз |
①SiRNA түргө мүнөздүү жана ар кандай түрлөрдүн тизмеги ар кандай болот.
②SiRNA тоңдурулган кургатылган порошокто таңгакталган, аны бөлмө температурасында 2-4 жума туруктуу сактоого болот.
2.3 Алдын ала даярдалышы керек болгон шаймандар же реактивдер
| Праймер (ички маалымдама) | Анын ичинде алдыга жана артка эки |
| Праймерлер (максаттуу ген) | Анын ичинде алдыга жана артка эки |
| Максаттуу Si РНК (3 тилке) | Жалпысынан алганда, компания 3 тилкесин синтездейт, андан кийин RT-PCR аркылуу үчөөнүн бирин тандайт. |
| Transfection Kit | Lipo2000 ж.б. |
| RNA Rapid Extraction Kit | Трансфекциядан кийин РНКны алуу үчүн |
| Rapid Reverse Transscription Kit | cDNA синтези үчүн |
| ПЦР күчөтүү комплекти | 2×Super SYBR Green qPCR Master Mix |
2.4 Конкреттүү эксперименттик кадамдарда көңүл буруу керек болгон маселелерге карата:
①siRNA трансфекция процесси
1. Каптоо үчүн сиз 24 кудуктуу пластинканы, 12 скважиналуу табакчаны же 6 көзөнөктүү табакчаны тандай аласыз (24 скважинанын ар бир скважинасында сунушталган орточо РНК концентрациясы болжол менен 100-300 нг/уЛ), ал эми клеткалардын оптималдуу трансфекция тыгыздыгы 60% -80% же андан да көп.
2. Transfection кадамдары жана конкреттүү талаптар көрсөтмөлөргө так ылайык келет.
3. Трансфекциядан кийин үлгүлөрдү mRNA аныктоо (RT-PCR) же 48-96 сааттын ичинде протеинди аныктоо үчүн 24-72 сааттын ичинде чогултулушу мүмкүн (ВБ)
② РНК экстракция процесси
1. Экзогендик ферменттер менен булганууну алдын алуу.Бул негизинен беткаптарды жана кол каптарды кийүүнү камтыйт;стерилденген пипеткалардын учтарын жана EP түтүктөрүн колдонуу;экспериментте колдонулган суу RNase-Free болушу керек.
2. Бул чындап тазалыгын жана түшүмдүүлүгүн жакшыртат тез экстракция комплектинде сунушталган эки эсе кылуу сунушталат.
3. Таштанды суюктук РНК мамычасына тийбеши керек.
③ РНКны сандык аныктоо
РНК алынгандан кийин, аны Nanodrop менен түздөн-түз эсептөөгө болот жана минималдуу көрсөткүч 10нг/улга чейин төмөн болушу мүмкүн.
④Тескери транскрипция процесси
1. RT-qPCR жогорку сезгичтигинен улам, кийинки Ct өтө ар түрдүү болушун же статистикалык талдоо үчүн SD өтө чоң болбошу үчүн ар бир үлгү үчүн кеминде 3 параллелдүү скважина жасалышы керек.
2. Мастер аралашманы кайра-кайра тоңдурбаңыз жана эритпеңиз.
3. Ар бир түтүк/тешик жаңы учу менен алмаштырылышы керек!Үлгүлөрдү кошуу үчүн бир эле пипетка учун тынымсыз колдонбоңуз!
4. Үлгү кошулгандан кийин 96 скважинага бекитилген пленканы табак менен тегиздөө керек.Түтүк дубалындагы суюктук ылдый агып, аба көбүктөрүн алып салышы үчүн, аны машинага коюунун алдында центрифугалоо эң жакшы.
⑤ Жалпы ийри талдоо
| Логарифмдик өсүү мезгили жок | Калыптын жогорку концентрациясы болушу мүмкүн |
| КТ мааниси жок | Флуоресценттик сигналдарды аныктоо үчүн туура эмес кадамдар; праймерлердин же зонддордун бузулушу – анын бүтүндүгүн PAGE электрофорези аркылуу аныктоого болот; шаблондун жетишсиз саны; шаблондордун деградациясы – үлгүлөрдү даярдоодо аралашмалардын жана кайра-кайра тоңдуруу жана эритүүнү болтурбоо; |
| Ct>38 | Төмөн күчөтүү натыйжалуулугу;ПЦР продукт өтө узун;ар кандай реакция компоненттери бузулат |
| Сызыктуу күчөтүү ийри сызыгы | Зонддор кайра-кайра тоңуу-эрүү циклдары же жарыктын узакка созулган таасири аркылуу жарым-жартылай бузулушу мүмкүн. |
| Кайталанма тешиктердин айырмасы өзгөчө чоң | реакция эритмеси толук эрибейт же реакция эритмеси аралашпайт;ПЦР аспабынын термикалык ваннасы флуоресценттик заттар менен булганган |
2.5 Маалыматтарды талдоо жөнүндө
qPCR маалыматтарды талдоо салыштырмалуу сандык жана абсолюттук сандык бөлүүгө болот.Мисалы, башкаруу тобундагы клеткалар менен салыштырганда дарылоо тобундагы клеткалар,
X генинин мРНКсы канча жолу өзгөрөт, бул салыштырмалуу сандык аныктоо;клеткалардын белгилүү санында, X генинин мРНКсы
Канча нуска бар, бул абсолюттук сандык көрсөткүч.Адатта, биз лабораторияда эң көп колдонгон нерсе салыштырмалуу сандык ыкма.Адатта,2-ΔΔct ыкмасыэксперименттерде эң көп колдонулат, ошондуктан бул жерде бир гана бул ыкма майда-чүйдөсүнө чейин киргизилет.
2-ΔΔct ыкмасы: Алынган натыйжа контролдук топтогу максаттуу генге салыштырмалуу эксперименталдык топтун максаттуу генинин экспрессиясынын айырмасы болуп саналат.Максаттуу гендин да, ички референттик гендин да күчөтүү эффективдүүлүгү 100%га жакын болушу талап кылынат, ал эми салыштырмалуу четтөө 5%дан ашпашы керек.
Эсептөө ыкмасы төмөнкүдөй:
Δct контролдоо тобу = контролдук тобундагы максаттуу гендин ct мааниси – контролдук топтогу ички шилтеме генинин ct мааниси
Δct эксперименталдык топ = эксперименталдык топтун максаттуу генинин ct мааниси – эксперименталдык топтун ички эталондук генинин ct мааниси
ΔΔct=Δct эксперименталдык топ-Δct контролдоо тобу
Акыр-аягы, туюнтма деңгээлиндеги айырманын эселенген санын эсептеңиз:
Fold = 2-ΔΔct өзгөртүү (excel функциясына туура келет POWER)
Тектеш продуктылар:
Посттун убактысы: 20-май-2023
