Клейди калыбына келтирүүнү жакшыртуу боюнча кеңештер

1. Электрофорез учурунда үлгү жүгүн көбөйтүү.

2. Жаңы даярдалган электрофорез буферин колдонуңуз.

3. Желимди кесүүдө клейди кесүү көлөмүн азайтуу үчүн тилкелер менен гана кесүүгө аракет кылыңыз: бир нече максаттуу фрагменттери бар желимдин кереги жок, антпесе ал калыбына келтирүү ылдамдыгына таасирин тийгизет.

4. Эки же андан көп желимди эриткенден кийин көлөмү канчалык чоң болсо да түтүктү колдонуңуз жана аны ошол эле колонкага өткөрүңүз.

5. Sol кошулган эритме бир аз көбүрөөк болушу мүмкүн, бул мембрана менен ДНКнын байланышы үчүн жагымдуу, бирок жалпысынан 750ul ашпайт.

6. Гельди калыбына келтирүүнүн ачкычы колоннадагы эритменин туз концентрациясы, кычкылдыгы (заряд) жана гидрофобдугу аркылуу ДНКны колонка менен байланыштыруу болуп саналат.Демек, электрофорез буферинин рН өтө жогору болсо, зольге 10ул (рН 5,0, 3моль/л NaAC) кошууга болот;мембранадагы ДНК молекулаларын жакшыраак кармап калуу үчүн, клей эригенден кийин суюктукка ысытуу үчүн 30% изопропанол кошулса болот.

7. Элюентти кошуунун алдында этанолду толук буулантуу үчүн колонканы бөлмө температурасында бир нече мүнөткө (болжол менен 10 мүнөт) калтырыңыз.

8. Акырында, калыбына келтирүү көлөмүн азайтуу үчүн азыраак элюент кошуңуз.Негизинен, 30-50мкл элюент элюция үчүн колдонулат (өтө аз эмес, антпесе ал элюцияга ыңгайлуу эмес мембрананы нымдай албайт);мембрана менен байланышкан ДНКны толугу менен элюциялоо үчүн, элюциялык тамчылар мембрананын борборунда жайгашкан.

9. Элюентти кошкондон кийин аны 55 градус суу мончосунда 5 мүнөт элюциялоого болот же 50 градустагы суу мончосуна 10 мүнөттөн ашык убакытка коюуга болот, же түнү бою 4 градуста парафильм менен бекитип, андан кийин эртеси калыбына келтирүү үчүн центрифугадан өткөрсө болот, эффект жакшы болот.

10. Центрифугаланган элюатты кайра адсорбциялык колоннага кошуп, кайра центрифугалаңыз.

ПЦР продуктуларын калыбына келтирүүнүн деталдуу ыкмалары жана процедуралары

1. Каучукту кадимкидей кайра иштетүү

Эгерде сиз клейди калыбына келтиргиңиз келсе, анда ыңгайлуу жана калыбына келтирүү ылдамдыгы бир аз жогору болгон комплектти колдонуу жакшы.Эгер чындап эле кол менен калыбына келтирүү керек болсо, анда клей кесип кийин 3 эсе көлөмүн TE кошууга болот.Суу мончосунда эриткенден кийин фенол, фенол/хлороформ таза экстракцияланып, этанол чөктүрүлөт.Дал ушул.

2. Эрүү температурасы төмөн гелдерден ДНКны калыбына келтирүү

ДНК фрагменттерин тазалоо Гельдин көлөмүнө барабар TE (10 ммоль/л Tris-HCl pH8,0, 0,1 ммоль/л ЭДТА) кошуп, гелди толук эритүү үчүн 65°С суу мончосуна 5 мүнөткө коюңуз.

Бөлмө температурасына чейин жеткирилгенден кийин, бирдей өлчөмдөгү фенол (ТЭ менен каныккан, ТЭ үстүңкү катмарга жабылып, фенолдун төмөнкү катмары алынып салынды) кошулуп, аралашма акырын аралаштырылды (аралаштыруу талап кылынбайт) жана 12000 айн/мин ылдамдыкта 3 мүнөт центрифугадалат.1-2 жолу кайталаъыз.

Супернатантты алып, этанолду тундурууну жүргүзүү үчүн 0,1 көлөмдөгү 3моль/л натрий ацетатын (рН 5,2) жана абсолюттук этанолдун 2,5 эсе көлөмүн кошуңуз.Тазаланган ДНКны тиешелүү сандагы ТЭ менен эритип, мазмунун өлчөп, колдонууга даярдайт (ал максаттуу ген структурасын анализдөө, зонд даярдоо ж.б. үчүн колдонсо болот).

3. Жакшы күчөтүү өзгөчөлүгү менен ПЦР калыбына келтирүү

ПЦР күчөтүү өзгөчөлүгү жакшы болсо, бул жөн гана ПТР продуктуну жөнөкөй тазалоо жана калыбына келтирүү болуп саналат.Сиз ПТР продуктусуна 50ug/ml протеиназа К кошуп, 37 градуска 1 саатка, фенол/хлороформ менен бир жолу экстракт, хлороформ менен бир жолу экстракт жана супернатанттын 0,1 көлөмүн кошо аласыз.Натрий ацетаты 2,5 көлөмдө абсолюттук этанол менен тумоо жолу менен алынган.

Тектеш продуктылар:

https://www.foreivd.com/pcr-purification-kit-2-product/

https://www.foreivd.com/blood-superdirecttm-pcr-kit-edta-product/