• ПТР аз өлчөмдөгү ДНК шаблонунан ДНКны күчөтүү үчүн колдонулган ыкма.RT-PCR РНК булагынан ДНК шаблонун өндүрүү үчүн тескери транскрипцияны колдонот, аны андан кийин күчөтүүгө болот.
• ПТР жана RT-PCR адатта акыркы чекиттик реакциялар болуп саналат, ал эми qPCR жана RT-qPCR учурда калыптын санын аныктоо үчүн ПТР реакциясы учурунда продукт синтезинин ылдамдыгынын кинетикасын колдонушат.
• Санариптик ПТР сыяктуу жаңыраак ыкмалар ДНКнын баштапкы шаблонунун абсолюттук санын аныктоону камсыз кылат, ал эми изотермикалык ПТР сыяктуу ыкмалар ишенимдүү натыйжаларды берүү үчүн кымбат баалуу жабдууларга болгон муктаждыкты азайтат.

Полимераздык чынжыр реакциясы (ПТР) – бул ДНК жана РНК тизмектерин күчөтүү жана аныктоо үчүн салыштырмалуу жөнөкөй жана кеңири колдонулган молекулярдык биология ыкмасы.Көбүнчө бир нече күн талап кылынуучу ДНКны клондоштуруунун жана күчөтүүнүн салттуу ыкмаларына салыштырмалуу ПЦР бир нече саатты гана талап кылат.ПТР өтө сезгич жана конкреттүү ырааттуулуктарды аныктоо жана күчөтүү үчүн минималдуу шаблонду талап кылат.Негизги ПТР ыкмалары жөнөкөй ДНКны жана РНКны аныктоодон дагы өнүккөн.Төмөндө биз сиздин изилдөө муктаждыктарыңыз үчүн Enzo Life Sciences компаниясында берген ар кандай ПТР ыкмалары жана реагенттер жөнүндө жалпы маалымат бердик.Биз илимпоздорго кийинки изилдөө долбоорунда колдонуу үчүн ПТР реагенттерине тез жетүүгө жардам берүүнү максат кылабыз!

ПЦР

Стандарттык ПТР үчүн сизге ДНК полимераза, магний, нуклеотиддер, праймерлер, күчөтүлө турган ДНК шаблону жана термоцикл керек.ПТР механизми өзүнүн максаты сыяктуу эле жөнөкөй: 1) кош тизмектүү ДНК (dsDNA) жылуулук менен денатуратталган, 2) праймерлер бир ДНК тилкелерине туура келет жана 3) праймерлер ДНК полимераза менен узартылат, натыйжада ДНКнын эки көчүрмөсү пайда болот. баштапкы ДНК тизмеги.Бир катар температуралар жана убакыттар боюнча денатурация, күйүү жана узартуу процесси күчөтүүнүн бир цикли деп аталат (1-сүрөт).

Циклдин ар бир кадамы колдонулган шаблон жана праймер топтому үчүн оптималдаштырылышы керек.Бул цикл болжол менен 20-40 жолу кайталанат жана күчөтүлгөн продукт, адатта, агароз гели менен талданышы мүмкүн (2-сүрөт).

ПТР өтө сезгич ыкма болгондуктан жана бир реакциялар үчүн өтө аз көлөм талап кылынгандыктан, бир нече реакциялар үчүн мастер-микс даярдоо сунушталат.Мастер аралашманы жакшылап аралаштырып, андан кийин реакциялардын санына бөлүү керек, ар бир реакцияда бирдей сандагы фермент, dNTP жана праймер камтылат.Enzo Life Sciences сыяктуу көптөгөн жеткирүүчүлөр, ошондой эле праймерлерден жана ДНК шаблонунан башка бардыгын камтыган ПТР аралашмаларын сунуштайт.

Гуанинге/цитозинге бай (GC-бай) аймактар ​​стандарттык ПТР ыкмаларында кыйынчылык жаратат.GCге бай ырааттуулуктар GC мазмуну төмөн ырааттууларга караганда туруктуураак.Андан тышкары, GCге бай ырааттуулуктар чачтын илмектери сыяктуу экинчи даражадагы структураларды түзүүгө умтулат.Натыйжада, ГК-га бай кош жиптер денатурация фазасында толук бөлүнүү кыйынга турат.Демек, ДНК-полимераза жаңы жипти эч кандай тоскоолдуксуз синтездей албайт.Денатурациянын жогорку температурасы муну жакшыртат, ал эми жогорку күйдүрүү температурасына жана кыска күйдүрүү убактысына карата оңдоолор GCге бай праймерлердин спецификалык эмес байланышын алдын алат.Кошумча реагенттер GC-бай ырааттуулуктун күчөтүлүшүн күчөтүшү мүмкүн.DMSO, глицерин жана бетаин GC өз ара аракеттенүүсү менен шартталган экинчи структураларды бузууга жардам берет жана ошону менен кош жиптердин бөлүнүшүн жеңилдетет.

Hot Start PCR

Белгилүү эмес күчөтүү ПТР учурунда пайда болушу мүмкүн болгон көйгөй.ПТР үчүн колдонулган ДНК полимеразаларынын көбү 68°Cден 72°Cге чейинки температурада эң жакшы иштейт.Фермент, бирок, төмөнкү температурада да, азыраак болсо да, активдүү боло алат.Күйүү температурасынан бир топ төмөн температурада праймерлер спецификалык эмес байланышып, реакция музда орнотулган күндө да спецификалык эмес күчөтүүгө алып келиши мүмкүн.Бул белгилүү бир температурага жеткенде гана ДНК-полимеразадан диссоциациялануучу полимераз ингибиторлорун колдонуу менен алдын алууга болот, демек ысык баштоо ПТР деген термин.Ингибитор полимеразаны байланыштырган жана денатурациянын баштапкы температурасында (адатта 95°C) денатурациялануучу антитело боло алат.

Жогорку тактыктагы полимераз

ДНК-полимеразалар баштапкы калыптын ырааттуулугуна жетишээрлик так күчөп жатканда, нуклеотиддердин дал келүүсүндө каталар болушу мүмкүн.Клондоо сыяктуу тиркемелердеги дал келбестиктер кыскартылган транскрипттерге жана ылдый жакта туура эмес которулган же активдүү эмес белокторго алып келиши мүмкүн.Бул дал келбестиктерди болтурбоо үчүн, "коррекциялоо" активдүүлүгү бар полимеразалар аныкталып, иш процессине киргизилген.Биринчи текшерүүчү полимераза, Pfu, 1991-жылы Pyrococcus furiosus менен аныкталган.Бул Pfu энзим 3' 5' экзонуклеаза активдүүлүгүнө ээ.ДНК күчөгөн сайын экзонуклеаза жиптин 3' учундагы дал келбеген нуклеотиддерди жок кылат.Андан кийин туура нуклеотид алмаштырылат жана ДНК синтези уланат.Туура эмес нуклеотид ырааттуулугун аныктоо фермент менен туура нуклеозид-трифосфат менен байланыштыруу жакындыгына негизделет, мында натыйжасыз байланыш синтезди жайлатат жана туура алмаштырууга мүмкүндүк берет.Pfu полимеразанын текшерүү активдүүлүгү Taq ДНК полимеразасына салыштырмалуу акыркы ырааттуулукта азыраак каталарга алып келет.Акыркы жылдарда башка текшерүү ферменттери аныкталды жана ДНКны күчөтүү учурунда катаны азайтуу үчүн баштапкы Pfu ферментинин модификациялары жасалды.

RT-PCR

Тескери транскрипциялуу ПТР, же RT-PCR, РНКны шаблон катары колдонууга мүмкүндүк берет.Кошумча кадам РНКны аныктоого жана күчөтүүгө мүмкүндүк берет.РНК тескери транскриптазаны колдонуу менен комплементарлык ДНКга (cDNA) кайра транскрипцияланат.РНК үлгүсүнүн сапаты жана тазалыгы RT-PCRдин ийгилиги үчүн маанилүү.RT-PCRдин биринчи кадамы ДНК/РНК гибридинин синтези болуп саналат.Тескери транскриптаза ошондой эле гибриддин РНК бөлүгүн начарлатуучу RNase H функциясына ээ.Бир саптуу ДНК молекуласы андан кийин кДНКга тескери транскриптаздын ДНКга көз каранды ДНК полимераза активдүүлүгү менен аяктайт.Биринчи катардагы реакциянын эффективдүүлүгү күчөтүү процессине таасир этиши мүмкүн.Мындан ары стандарттуу ПТР процедурасы cDNAны күчөтүү үчүн колдонулат.RT-PCR аркылуу РНКны cDNAга кайтаруу мүмкүнчүлүгү көп артыкчылыктарга ээ жана ал биринчи кезекте ген экспрессиясын талдоо үчүн колдонулат.РНК бир тилкелүү жана өтө туруксуз болгондуктан, аны менен иштөө кыйынга турат.Ал, адатта, биологиялык үлгүдөгү РНК транскрипттерин сандык аныктоочу qPCRдин биринчи кадамы катары кызмат кылат.

qPCR жана RT-qPCR

Сандык ПТР (qPCR) көптөгөн колдонмолор үчүн нуклеиндик кислоталарды аныктоо, мүнөздөө жана санын аныктоо үчүн колдонулат.RT-qPCRде РНК транскрипттери көбүнчө жогоруда сүрөттөлгөндөй, аларды cDNAга тескери транскрипциялоо жолу менен сандык аныкталат, андан кийин qPCR жүргүзүлөт.Стандарттык ПТРдегидей эле, ДНК үч кайталануучу кадам менен күчөтүлөт: денатурация, күйүү жана узартуу.Бирок, qPCRде флуоресценттик этикеткалоо ПТР прогрессинде маалыматтарды чогултууга мүмкүндүк берет.Бул ыкманын көптөгөн артыкчылыктары бар, анткени методдор жана химиялар жеткиликтүү.

Боёкко негизделген qPCRде (адатта жашыл) флуоресценттик этикеткалоо dsDNA байланыштыруучу боёкту колдонуу менен күчөтүлгөн ДНК молекулаларынын санын аныктоого мүмкүндүк берет.Ар бир цикл учурунда флуоресценция өлчөнөт.Флуоресценттик сигнал репликацияланган ДНКнын көлөмүнө пропорционалдуу түрдө көбөйөт.Демек, ДНК "реалдуу убакытта" сандык бааланат (3-сүрөт).Боёктун негизиндеги qPCRдин кемчиликтери бир эле учурда бир гана максатты изилдөөгө болот жана боёк үлгүдөгү ар кандай ds-ДНК менен байланышат.

Зондго негизделген qPCRде ар бир үлгүдө бир эле учурда көптөгөн максаттарды аныктоого болот, бирок бул оптималдаштырууну жана праймерлерден тышкары колдонулган максатка тиешелүү зонд(тарды) долбоорлоону талап кылат.Зонд конструкцияларынын бир нече түрлөрү бар, бирок эң кеңири таралган түрү флюорофорду жана өчүргүчтү камтыган гидролиздик зонд.Флуоресценттик резонанстык энергияны өткөрүү (FRET) зонд бүтүн бойдон өчүргүч аркылуу флюорофордун чыгарылышын алдын алат.Бирок, ПТР реакциясы учурунда зонд праймерди узартуу жана ал байланышкан белгилүү ырааттуулукту күчөтүү учурунда гидролизденет.Зонддун бөлүнүшү флюорофорду өчүргүчтөн бөлүп, флуоресценциянын күчөшүнө көз каранды болушуна алып келет (4-сүрөт).Ошентип, зонддун негизиндеги qPCR реакциясынын флуоресценттик сигналы үлгүдөгү зонддун максаттуу ырааттуулугунун көлөмүнө пропорционалдуу.Зонд негизиндеги qPCR боёкко негизделген qPCRге караганда өзгөчө болгондуктан, ал көбүнчө qPCR негизиндеги диагностикалык анализдерде колдонулган технология.

Изотермикалык күчөтүү

Жогоруда айтылган ПТР ыкмалары денатурация, күйгүзүү жана узартуу кадамдары үчүн камеранын температурасын өйдө жана ылдый так жогорулатуу үчүн кымбат термоциклдик жабдууларды талап кылат.Мындай так приборлорго муктаж болбогон бир катар техникалар иштелип чыккан жана аларды жөнөкөй суу мончосунда же кызыккан клеткалардын ичинде да аткарууга болот.Бул ыкмалар жалпысынан изотермикалык күчөтүү деп аталат жана экспоненциалдык, сызыктуу же каскаддык күчөтүүгө негизделген.

Изотермикалык күчөтүүнүн эң белгилүү түрү бул циклдик изотермикалык күчөтүү же LAMP.LAMP шаблон ДНКсын же РНКны күчөтүү үчүн 65⁰Cде экспоненциалдык күчөтүүнү колдонот.LAMP аткарып жатканда, жаңы ДНКны синтездөө үчүн ДНК полимераза менен максаттуу ДНКнын аймактарын толуктаган төрт-алты праймер колдонулат.Бул праймерлердин экөөсү башка праймерлердеги ырааттуулуктарды таанып, аларды байланыштырган кошумча ырааттуулукка ээ, бул жаңы синтезделген ДНКда "цикл" структурасын түзүүгө мүмкүндүк берет, ал андан кийин күчөтүүнүн кийинки раунддарында праймерди күйгүзүүгө жардам берет.LAMP флуоресценция, агароз гел электрофорези же колориметрияны кошкондо бир нече ыкмалар менен көрүүгө болот.Колориметрия аркылуу продуктунун бар же жок экенин визуализациялоо жана аныктоонун оңойлугу жана кымбат баалуу жабдуулардын жоктугу LAMPти клиникалык лабораториялык тестирлөө оңой болбогон аймактарда SARS-CoV-2 тестирлөө үчүн ылайыктуу вариант кылды, же үлгүлөрдү сактоо жана ташуу. ишке ашыруу мүмкүн эмес болчу, же мурда ПТР термоциклдик жабдуулары жок лабораторияларда.