RNase – бул сезгич сөз, аны РНКны экстракциялоо боюнча эксперименттерди көп жүргүзгөн көптөгөн студенттер уккусу келбейт.Толугу менен куралданып, акыры өтө уулуу реагенттер фенол жана хлороформ менен алынган РНК бузулган.Мен жарашпайм!!!Бүгүн, келгиле, атактуу Rnase келип чыгышын карап көрөлү.

Рибонуклеаза (RNase) же RNase - бул РНКны майда молекулаларга гидролиздөөчү нуклеаза.RNase кичинекей молекулалуу белок катары адаттан тыш туруктуу .Кадимки жогорку температурадагы жана жогорку басымдагы буу менен стерилдөө жана белок ингибиторлору аны толугу менен активдештире албайт.RNase туруктуулугу негизинен түзүлүштөгү дисульфиддик байланыштардан келип чыгат.Мисалы, уйку безинин көбүнчө колдонулган RNase курамында 124 гана аминокислота бар, бирок 4 дисульфиддик байланыш бар.Күкүрт байланышы жана дисульфиддик байланыш RNaseге эң сонун жылуулук туруктуулугун берет.Мындан тышкары, rnase салыштырмалуу кичинекей молекулярдык салмакка ээ жана көп учурларда анын баштапкы конформациясын тез калыбына келтире алат.

Абдан туруктуу болуу менен бирге,RNases лабораторияда бардык жерде бар .RNase биологиялык коргонуу механизми болуп саналат.Клетка үчүн экзогендик РНК көбүнчө өлүмгө алып келет.Экзогендик ДНК менен салыштырганда, экзогендик РНК көбүнчө коркунучтуу.РНК бактылуу транскрипцияланат жана которулат, ошондуктан дээрлик бардык организмдер экзогендик РНКнын чабуулунан коргонуу үчүн RNases эволюциялашкан.Демек, лабораторияда өстүрүлгөн бактерия клеткалары жана РНКны бөлүп чыгарган сиз RNase жытын чыгарасыз.Адамдын денесиндеги суюктуктарда (шилекей, көз жаш ж.б.) көп сандагы РНаза бар, ошондуктан РНК бузулганда ыйлабаңыз.Канчалык көп ыйласаңыз, РНКнын бузулушу ошончолук начарлайт!!Дайю эже РНКны алуу үчүн ылайыктуу эмес!

Мындан тышкары, назик териңизде да көп RNase бар жана тери тийген маркерлер, пипеткалар, муздаткыч эшиктери жана эшик туткаларында да RNase бар.

Ушунчалык көп чатак менен, келгиле, RNases менен кантип күрөшүү керектигин карап көрөлү.

РНКны алып салууда ар кимдин ойлогон эң биринчи нерсесиDEPC(диэтил пирокарбонат).DEPC негизинен гистидиндин RNase активдүү тобундагы имидазол шакеги менен биригип, протеинди денатурациялайт, ошону менен ферменттин активдүүлүгүн токтотот.0,1% DEPC Rnase боюнча жакшыраак жок кылуучу таасирге ээ болушу мүмкүн, бирок биз DEPC белгилүү канцероген экенине көңүл бурушубуз керек, ошондуктан аны колдонууда өзгөчө көңүл буруу керек.

RNase үчүн биз эки тараптан башташыбыз керек,биринчиси - эндогендик RNase активдүүлүгүнө бөгөт коюу

Тризолдун курамындагы гуанидин изоцианаты жана DTT сыяктуу кадимки РНК экстракциялоо реагенттери RNase дисульфиддик байланышын ача алат, бирок дагы эле кээ бир RNase бар, айрыкча кыртыш үлгүлөрүндө, андыктан төмөнкү температурага көңүл буруңуз.

1.Ткань үлгүсүн алып чыккандан кийин дароо суюк азотко же РНКны коммерциялык сактоочу эритмеге батырыңыз.

2.Клетка үлгүсүнүн РНКсын бөлүп алгандан кийин, аны лизис эритмесине кошуп, муз кутучасында лизистеңиз.

3. Майдалоо үчүн суюк азотту колдонуу эң жакшы кыртыш үлгүлөрү гомогендештирилгенде.Суюк азоту жок электрдик гомогенизаторду колдонууда гомогенат адаптерин толугу менен алдын ала муздатууга көңүл буруңуз.

Экинчиси - экзогендик DNase

1.Толук куралданыңыз, лабораториялык халат кийиңиз, беткап кийиңиз жана жаңы колкап кийиңиз (анчалык үнөмдүү болбоңуз! Белгилей кетчү нерсе, Тризол супер коррозиялык, ал эми колкап аркылуу да абдан күчтүү, андыктан колуңузга тамчылатпаңыз).

2.Бардык колдонулган пипетка учтары, EP түтүктөрү, ПТР түтүктөрү жана башка жабдуулар де-RNase менен тазаланууга тийиш.Аны 0,1% DEPCге чылап, андан кийин жогорку басымда басымга салууга болот.Түтүн капотундагы операцияга көңүл буруңуз.Жергиликтүү тирандар ферменттерди жок кылуу үчүн керектелүүчү материалдарды түздөн-түз сатып ала алышат.

PS: Мен сизге бир жалкоо ыкманы айтып берейин.Жогорку температура жана жогорку басым RNaseди толугу менен жок кыла албаса да, анын көп бөлүгүн жок кылат.2 жолу жогорку температура жана жогорку басым жакшы таасир этет, ал эми РНКны бөлүп алуу аз натыйжа берет.

3.Спирт протеиндерди денатурациялай алат,ошондуктан РНКны алуу үстөлүн 75% спирт менен сүртсө болот , жана колкаптарды спирт менен чачса болот.

4.Акыркы РНКны эритүүчү эритмени жана центрифуга түтүгүн да де-РНаз менен тазалоо керек.DEPC суу көп колдонулган РНК эритүүчү чечим болуп саналат.Келгиле, DEPC суусун туура даярдоо ыкмасы жөнүндө сүйлөшөлү (сатып алууда коммерциялык DEPCди кайра таңгактоо керек)

1: 1000 өтө таза сууга DEPC кошуп, жакшылап чайкап, 37°C түнгө калтырып, 121°С жогорку температурада жана жогорку басымда 15 мүнөт стерилизациялайбыз.DEPC суусун 1 мл аликвоттордо -20°С температурада сактоого болот.

Акыр-аягы, жыйынтыктоо үчүн: төмөнкү температура негизги болуп саналат, керектелүүчү материалдар жакшы иштетилет, толук куралданган жана азыраак сүйлөшөт!

Ооба, бул бүгүнкү стратегия үчүн.Сиз айткан РНК концентрациясын жана тазалыгын каалайм.A260/A280 экөө тең 2.0!!!

Албетте, эгерде сиз абөлмө температурасында иштөө РНК экстракция комплекти, сиз жогорудагы кыйынчылыктарга туш болбошуңуз мүмкүн.

Бөлмө температурасында операция, DNase кошпостон, 11 мүнөттүн ичинде клеткалардан жалпы РНКны бөлүп алат жана 30 мүнөттүн ичинде жаныбарлардын ткандарынан же өсүмдүктөрдөн жалпы РНКны бөлүп алат.

Сыноо үлгүлөрүн алуу үчүн төмөнкүгө кайрылыңыз:overseas@foregene.com

Тектеш продуктылар:

https://www.foreivd.com/cell-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/animal-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/plant-total-rna/