Real Time ПТР, ошондой эле сандык ПТР же qPCR катары белгилүү, ПТР күчөтүү продуктуларын реалдуу убакыт мониторинг жана талдоо ыкмасы болуп саналат.
Сандык ПТР жөнөкөй операция, тез жана ыңгайлуу, жогорку сезгичтик, жакшы кайталануу жана булгануу ылдамдыгынын артыкчылыктарына ээ болгондуктан, ал медициналык тестирлөөдө, дары-дармектин натыйжалуулугун баалоодо, ген экспрессиясын изилдөөдө, трансгендик изилдөөдө, генди аныктоодо, патогенди аныктоодо, жаныбарларды жана өсүмдүктөрдү аныктоодо кеңири колдонулат., тамак-аш сыноо жана башка тармактарда.
Ошондуктан, сиз жашоо илимдери боюнча фундаменталдуу изилдөөлөр менен алектенесизби, же фармацевтикалык компаниялардын, мал чарба компанияларынын, тамак-аш ишканаларынын кызматкерлери, ал тургай, кирүү-чыгыш инспекциясынын жана карантиндик бюролордун, экологиялык мониторинг бөлүмдөрүнүн, ооруканалардын жана башка бөлүмдөрдүн кызматкерлериби, сиз аздыр-көптүр таасир этесиз же сандык ПТРди өздөштүрүү боюнча билимди билишиңиз керек.

Реалдуу убакыттагы ПТР принциби

Реалдуу убакыттагы ПТР – бул флуоресценттик заттар ПТР реакциясынын системасына кошулган жана ПТР реакциясынын процессинде флуоресценттик сигналдын интенсивдүүлүгү реалдуу убакыт режиминде сандык ПТР аспабы аркылуу көзөмөлдөнүп, акырында эксперименталдык маалыматтар талданат жана иштетиле турган ыкма.

【Күчөтүү ийри сызыгы】ПТРдин динамикалык процессин сүрөттөгөн ийри сызык.ПЦРдин күчөтүү ийри сызыгы чындыгында стандарттык экспоненциалдык ийри эмес, сигмоиддик ийри сызык.

[Күчтүү ийри сызыгынын платформа фазасы]ПТР циклдеринин санынын көбөйүшү, ДНК-полимеразанын инактивацияланышы, dNTP жана праймерлердин азайышы жана пирофосфаттын кошумча продуктусу жана башкалар менен синтез реакциясынын бөгөт коюусу менен ПТР дайыма эле экспоненциалдуу түрдө кеңейе бербейт., жана акыры платого кирет.

[Күчтүү ийри сызыгынын экспоненциалдык өсүү аймагы]Плато фазасы абдан өзгөрүп турса да, күчөтүү ийри сызыгынын экспоненциалдык өсүү аймагынын белгилүү бир аймагында кайталануучулук абдан жакшы, бул ПТРдин сандык анализи үчүн абдан маанилүү.

[Босого маани жана Ct мааниси]Биз флуоресценцияны аныктоонун чектик маанисин күчөтүү ийри сызыгынын экспоненциалдык өсүү аймагындагы тиешелүү позицияга, тактап айтканда босого маанисине (Босого) койдук.Босого чоңдук менен күчөтүү ийри сызыгынын кесилиши Ct мааниси болуп саналат, башкача айтканда, Ct мааниси босого мааниге жеткендеги циклдердин санын (Босого цикл) билдирет.

Төмөнкү график босого сызыгы менен күчөтүү ийри сызыгынын, босогонун жана Ct маанисинин ортосундагы байланышты ачык көрсөтөт.

【Кантип эсептөө керек?】

Ct маанисинин баштапкы калыптардын санынын логарифмине тескери сызыктуу байланышы бар экендиги математикалык теория менен далилденген.Real Time ПТР реалдуу убакытта ПТР күчөтүү продуктуларын көзөмөлдөйт жана экспоненциалдык күчөтүү фазасында алардын санын аныктайт.

ПТРдин ар бир цикли үчүн ДНК экспоненциалдуу түрдө 2 эсеге көбөйүп, көп өтпөй платого жеткен.

Баштапкы ДНКнын көлөмү А₀ n циклден кийин ДНК продуктунун теориялык көлөмүн төмөнкүчө чагылдырууга болот:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Анда, ДНКнын баштапкы суммасы А 0 канчалык көп болсо, күчөтүлгөн продуктунун көлөмү An аныктоо маанисине ошончолук эрте жетет жана An жеткендеги циклдердин саны Ct маанисине жетет.Башкача айтканда, ДНКнын баштапкы суммасы А 0 канчалык көп болсо, күчөө ийри сызыгы ошончолук эртерээк чокусуна жетет жана ошончолук n циклдердин талап кылынган саны азыраак болот.

Биз белгилүү концентрация эталонун градиенттик суюлтууну ишке ашырабыз жана аны Реал Убакыттын ПТР үчүн шаблон катары колдонобуз, жана ДНКнын көлөмүнүн башталышы боюнча бирдей интервалдар менен бир катар ийри сызыктар алынат.Ct мааниси менен баштапкы калыптардын санынын логарифминин ортосундагы сызыктуу байланышка ылайык,[стандарттык ийри сызык] түзүлүшү мүмкүн.

Белгисиз концентрациялуу үлгүнүн Ct маанисин стандарттык ийри сызыкка алмаштыруу менен, анык убакыттагы ПТРдин сандык принциби болуп саналган белгисиз концентрациядагы үлгүнүн баштапкы шаблон өлчөмүн алууга болот.

Реалдуу убакыттагы ПТРдин аныктоо ыкмасы

Real Time ПТР реакция системасындагы флуоресценциянын интенсивдүүлүгүн аныктоо аркылуу ПТР күчөтүү продуктуларын аныктайт.

Флуоресценттик боёкторду киргизүү ыкмасынын принциби】

Флуоресценттик боёктор, мисалы, TB Green ® , ПЦР системаларында кош тизмектүү ДНКга спецификалык түрдө байланыша алат жана туташканда флуорессациялай алат.

Реакция системасындагы флуоресценция интенсивдүүлүгү ПТР циклдеринин көбөйүшү менен экспоненциалдуу түрдө жогорулады.Флуоресценциянын интенсивдүүлүгүн аныктоо менен реакция системасындагы ДНКнын күчөшүнүн көлөмүн реалдуу убакыт режиминде көзөмөлдөөгө болот, андан кийин үлгүдөгү баштапкы шаблондун көлөмүн тескери баалоого болот.

【Флуоресценттик зонд ыкмасынын принциби】

флуоресценттүү зонднуклеиндик кислотанын ырааттуулугу 5′ учунда флуоресценттик тобу жана 3′ учунда өчүрүү тобу бар, ал шаблон менен атайын байланыша алат.Зонд бүтүн болгондо, флуорофор чыгарган флуоресценция өчүрүүчү топ тарабынан өчүрүлөт жана флуоресценциялана албайт.Зонд ыдыраганда, флуоресценттик зат диссоциацияланып, флуоресценцияны чыгарат.

Флуоресценттик зонд ПЦР реакциясынын эритмесине кошулат.Жылдыруу процессинде флуоресценттик зонд шаблондун белгилүү бир абалына байланат.Кеңейтүү процессинде ПТР ферментинин 5′→3′ экзонуклеаздык активдүүлүгү шаблон менен гибриддештирилген флуоресценттүү зонду ыдыратышы мүмкүн, ал эми флуоресценттик зат флуоресцентти чыгаруу үчүн диссоциацияланат.Реакция системасында зонддун флуоресценция интенсивдүүлүгүн аныктоо менен ПТР продуктунун күчөтүлгөн көлөмүн көзөмөлдөө максатына жетүүгө болот.

【Флуоресценцияны аныктоо ыкмасын тандоо】

Эгерде ал жогорку гомологиядагы ырааттуулуктарды айырмалоо жана SNP терүү анализи сыяктуу мультиплекстүү ПТР аныктоо үчүн колдонулса, флуоресценттүү зонд ыкмасы алмаштырылгыс.
Реалдуу убакыттагы башка ПТР эксперименттери үчүн жөнөкөй, жеңил жана арзан флуоресценттүү химера ыкмасы колдонулушу мүмкүн.

probesStrong спецификасы, мультиплекстик ПТРге жөндөмдүү

Кемчилик

күчөтүү үчүн жогорку өзгөчөлүк талаптар;

мультиплекстүү ПТР жүргүзүү мүмкүн эмес. Конкреттүү зонддорду долбоорлоо керек, баасы жогору;

кээде зонд дизайн кыйын

Тектеш продуктылар: