RT-qPCR молекулярдык биологиянын негизги эксперименти болуп саналат жана ар бир адам аны жакшы билиши керек.Ал негизинен үч кадамды камтыйт: РНКны экстракциялоо, кДНКга тескери транскрипция жана реалдуу убакыт режиминде флуоресценттик сандык ПТР.Жардам бербейт, эмне болуп жатат?менен көйгөй бар болушу мүмкүнтескери транскрипция эксперименти!Тескери транскрипция экспериментине РНК, dNTP, праймерлер жанатескери транскриптазацентрифуга түтүгүнө салып, жакшылап аралаштырыңыз, бирок иш жүзүндө иштөө процессинде дагы эле көңүл буруу керек болгон көптөгөн деталдар бар.Келгиле, ал жөнүндө билели!

РНКнын сапатын кантип баалоого болот?
cDNA алуу үчүн, РНК сапаты абдан маанилүү!РНКнын сапаты негизинен эки аспектиден аныкталышы мүмкүн:
(1) РНКнын бүтүндүгү:РНКнын бүтүндүгүн агароз гел электрофорези аркылуу текшерүүгө болот. Мисал катары эукариотторду алсак, толук жалпы РНКда үч ачык тилке бар, молекулалык салмагы чоңдон кичинеге чейин 28S, 18S жана 5S, ал эми 28S 18Sден эки эсе жарык;үч тилке көрүнсө, бирок тилке түрү бүдөмүк болсо же Диффузия РНКнын жарым-жартылай бузулганын билдирет.Бул учурда, сураныч, тез арада тескери транскрипция реакциясын аткарып, шаблон киргизүүнү тийиштүү түрдө көбөйтүңүз;кичинекей молекулярдык салмагы бар тилке гана көрүнсө же тилке жок болсо, РНК толугу менен бузулган жана кайра экстракцияланышы керек.Agilent 2100 чокусу диаграммасы жана RIN мааниси менен РНКнын бүтүндүгүн көрсөтөт.Нуклеин кислотасы бүтүн болсо, электроферограмманын негизги сызыгы тегиз болот;нуклеин кислотасы катуу бузулса, базалык сызык бирдей эмес жана дагы деградациянын чокулары пайда болот;РНКнын мааниси РНКнын бүтүндүгүн чагылдырат, 0-10 диапазонунда, мааниси канчалык чоң болсо, РНКнын сапаты ошончолук жакшы болот.Ооба, толуктугунун даражасы жогору.
(2) РНКнын тазалыгы:OD260/280 катышын UV спектрофотометрия менен аныктоого болот.OD260/280 катышы 1,9 жана 2,1 ортосунда болсо, тазалыгы абдан жакшы.
Калдык геномдук ДНК так эмес сандык натыйжаларга алып келиши мүмкүн
РНК алынганда, биз алган РНК тазаланбаган геномдук ДНК (gDNA) менен аралашып кетиши мүмкүн.Демек, тескери транскрипциядан кийин cDNA да аралашатгДНК.Төмөнкү агым учурундаqPCRреакция,cDNAжана гДНК бир эле убакта күчтөндүрүлүшү мүмкүн, натыйжада салыштырмалуу аз КТ мааниси пайда болот, ошондуктан натыйжалар бир жактуу болушу мүмкүн.
Анда биз бул кырдаалда эмне кылышыбыз керек?Foregeneсунуш кылат:
(1) РНКны экстракциялоо учурунда мамычаны экстракциялоо менен жок кылынуучу тескери РНКда геномду тазалоону жүргүзүңүз;
(2) Алынган РНКны DNase менен иштетиңизI , бирок аны EDTA менен токтотуу;
тескери транскрипция реагенттеринингеномду тазалоо модулдары менен;

Тескери транскрипция үчүн праймерлерди кантип тандоо керек?
Тескери транскрипциянын праймерлери тескери транскрипция реакциясынын жыйынтыгына да таасирин тийгизет.Сиз эксперименттин конкреттүү шарттарына ылайык тескери транскрипция үчүн кокус праймерлерди, Oligo dT же генге тиешелүү праймерлерди тандай аласыз:
(1) Конкреттүү стенограммалар: генге тиешелүү праймерлер сунушталат;
(2) Узун фрагменттердин транскрипттери: Oligo dT/генге тиешелүү праймерлер сунушталат;
(3) Узун сегменттүү транскрипттердин ички фрагменттери: генге мүнөздүү праймерлер/ кокус праймерлер /кокус праймерлер + Oligo dT.Эгерде кийинки qPCR эксперименти аткарылса, Oligo dT жалгыз колдонулушу мүмкүн эмес, анткени Oligo dT жалгыз колдонуу 3′ соңку бурмалоого алып келиши мүмкүн, бул qPCR экспериментинин так эмес натыйжаларына алып келиши мүмкүн;
(4) миРНК: Стоп-луп праймерлери же калдыктарды сактоочу праймерлерди колдонсо болот.

Кайтарма транскрипция продуктусу cDNA канча жолу суюлтулган болушу керек?
Кайтарма транскрипция продуктунун cDNAсын алгандан кийин, qPCR эксперименттери үчүн кДНКны канча жолу суюлтуу керек экендиги абдан маанилүү.cDNA концентрациясы өтө жогору же өтө төмөн болсо, күчөтүү натыйжалуулугуна таасир этиши мүмкүн.cDNA концентрациясын өлчөөгө болобу жана аны кантип жасоо керек?
(1) Кайтарым транскрипция продуктунун cDNA концентрациясын өлчөө мүмкүн эмес, анткени cDNA продуктусунан тышкары, тескери транскрипция продуктусу тескери транскрипциянын калдык буферин, тескери транскриптазаны, праймерлерди ж.Бул убакта кээ бир достор айтышат, анда мен тазалангандан кийин концентрацияны өлчөйм;Бул жерде, Foregene cDNAны тазалоо сунушталбайт, анткени реверсациядан алынган cDNAнын узундугу ар башка жана тазалоодо кыска cDNA жоголуп кетерин эскертип кетким келет.
(2) Анда эмне кылуу керек?qPCR экспериментинин алдында cDNAнын суюлтуу градиентин алдын ала эксперимент аркылуу аныктоого болот.Мисалы: qPCR эксперименттери үчүн шаблон катары cDNA запастык эритмесин, 10 эсе суюлтууну жана 100 эсе суюлтууну колдонуңуз жана 18-28 диапазонундагы КТ мааниси менен суюлтуу факторун тандаңыз.

МиРНКны кантип тескери транскрипциялоо керек?
miRNA - протеинди коддобогон, болжол менен 22 нт өлчөмүндөгү бир тилкелүү кичинекей молекула РНК.Узундугу кыска болгондуктан, кадимки qPCR ыкмасы аны түздөн-түз аныктоо кыйынга турат, ошондуктан көбүнчө miRNAны узартуу керек болот;миРНК үчүн көбүнчө колдонулган тескери транскрипция ыкмаларына өзөк-укурук ыкмасы жана калдыктарды сактоо ыкмасы кирет.
Stem-loop ыкмасы - бул стебдик цикл праймерлерин кошуу менен miRNAны кеңейтүү.Бул аныктоо ыкмасы жогорку сезгичтикке жана өзгөчөлүккө ээ, бирок аныктоо өткөрүү жөндөмдүүлүгү төмөн.Бир тескери транскрипция бир гана миРНКны жана ички шилтемени аныктай алат;куйрук кошуу ыкмасы экиден турат Ал эки ферменттин биргелешкен аракети менен аяктайт, алар ПолиА полимераза жана тескери транскриптаза.PolyA полимераза анын узундугун көбөйтүү үчүн miRNAга PolyA куйруктарын кошууга жооптуу жана тескери транскриптаза тескери транскрипция реакциясын аткарат.Бул ыкма жогорку аныктоо өткөрүү жөндөмдүүлүгүнө ээ жана бир тескери транскрипцияда бир нече miRNA жана ички шилтемелерди аныктай алат, бирок сезгичтик жана өзгөчөлүк өзөк-укурук методунда төмөн.