RT-qPCR кадимки ПТР технологиясынан иштелип чыккан.Ал флуоресценттүү химиялык заттарды (флуоресценттик боёкторду же флуоресценттик зонддорду) салттуу ПТР реакция системасына кошуп, алардын ар кандай люминесценттик механизмдерине ылайык реалдуу убакытта ПТРди күйгүзүү жана узартуу процессин аныктайт.ПТРдин ар бир циклинде продуктунун өзгөрүү көлөмүн эсептөө үчүн чөйрөдөгү флуоресценттик сигналдын өзгөрүшү колдонулат.Азыркы учурда эң кеңири таралган ыкмалар флуоресценттик боёк ыкмасы жана зонд ыкмасы.

Fluorescent боёк ыкмасы:
Кээ бир флуоресценттик боёктор, мисалы, SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, ж.Ошондуктан, ПТР реакциясынын башында машина флуоресценттик сигналды аныктай албайт.Реакция күйгүзүү-узартуу (эки баскычтуу метод) же узартуу стадиясына (үч кадамдык ыкма) өткөндө, бул учурда кош жиптер ачылат жана жаңы ДНК полимераза Спирттик синтез учурунда флуоресценттик молекулалар dsDNA кичине оюкчасына биригип, флуоресценцияны бөлүп чыгарат.ПТР циклдеринин саны көбөйгөн сайын, көбүрөөк боектор dsDNA менен биригип, флуоресценттик сигнал да тынымсыз жогорулайт.Мисал катары SYBR Green Ⅰ алгыла.
Текшерүү ыкмасы:
Такман зонд - эң көп колдонулган гидролиздик зонд.Зонддун 5′ аягында флуоресценттик топ бар, адатта FAM.Зонддун өзү максаттуу генди толуктоочу ырааттуулук.Флуорофордун 3′ учунда флуоресценттик өчүрүүчү топ бар.Флуоресценттик резонанстык энергияны берүү принцибине ылайык (Förster резонанстык энергиянын трансфери, FRET), кабарчы флуоресценттик топ (донорлук флуоресценттик молекула) жана өчүрүүчү флуоресценттик топ (акцептордук флуоресценттик молекула) дүүлүктүрүү спектри бири-бирин кайталаганда жана флуоресценттик молекуланын аралыктары өтө жакын болгондо (7-10 нм флюоресценттик молекула), акцептордук молекула, ал эми автофлуоресценция алсыратат.Ошондуктан, ПТР реакциясынын башталышында, зонд системада бош жана бүтүн болгондо, репортер флуоресценттик топ флуоресценцияны чыгарбайт.Жылуулоодо праймер жана зонд шаблонго байланат.Узартуу стадиясында полимераз тынымсыз жаңы чынжырларды синтездейт.ДНК полимераза 5′-3′ экзонуклеаза активдүүлүгүнө ээ.Зондго жеткенде ДНК полимеразы калыбынан зондду гидролиздейт, репортер флуоресценттик тобун өчүрүүчү флуоресценттик тобунан бөлүп, флуоресценттик сигналды чыгарат.Зонд менен шаблондун ортосунда бирден-бир байланыш бар болгондуктан, сыноонун тактыгы жана сезгичтиги жагынан зонд ыкмасы боёк ыкмасынан жогору турат.

Fig 1 qRT-PCR принциби

Праймер дизайны
Принциптери:

Праймерлер нуклеиндик кислоталар сериясынын сакталган аймагында иштелип чыгышы жана өзгөчөлүккө ээ болушу керек.

Бул cDNA ырааттуулугун колдонуу жакшы, жана mRNA ырааттуулугу да алгылыктуу болуп саналат.Болбосо, ДНК ырааттуулугунун cds аймагынын дизайнын табыңыз.
Флуоресценттик сандык продуктунун узундугу 80-150 бит, эң узуну 300 бит, праймердин узундугу жалпысынан 17-25 базанын ортосунда жана агымдагы жана ылдыйкы праймерлердин ортосундагы айырма өтө чоң болбошу керек.

G+C мазмуну 40% жана 60% ортосунда, ал эми 45-55% эң жакшы.
ТМ мааниси 58-62 градустун ортосунда.
Праймердик димерлерден жана автодимерлерден качууга аракет кылыңыз, (4 жуп ырааттуу толуктоочу негиздер пайда болбошу керек) чачтын түзүлүшү, сөзсүз түрдө, ΔG<4,5кДж/моль* кылыңыз. Эгерде сиз тескери транскрипция учурунда gDNA алынып салынганына кепилдик бере албасаңыз, анда интрондун праймерлерин долбоорлоо эң жакшы TRI жана G регионунун модификацияланышына жол бербөө керек, G/C', A/G үзгүлтүксүз структурасы (2-3) праймерлер жана эмес
спецификалык Гетерогендүү күчөтүлгөн ырааттуулуктун гомологиясы 70% дан азыраак же 8 толуктоочу базалык гомологияга ээ.
Маалымат базасы:
CottonFGD ачкыч сөздөр боюнча издөө
Праймер дизайны:
IDT-qPCR праймер дизайны

Fig2 IDT онлайн праймер дизайн куралы бети

Fig3 натыйжа барагынын дисплейи
lncRNA праймерлеринин дизайны:
lncRNA:мРНК сыяктуу кадамдар.
miRNA:Дөңгөлөктүү цикл методунун принциби: Бардык miRNAлар болжол менен 23 нт кыска ырааттуулугу болгондуктан, түздөн-түз ПЦР аныктоо мүмкүн эмес, ошондуктан өзөк-укурук ырааттуулугу куралы колдонулат.Саңкы-укурук ырааттуулугу 50 нтке жакын бир тилкелүү ДНК болуп саналат, ал өзүнөн өзү чач кычкач түзүлүшүн түзө алат.3 'Акырын миРНКнын жарым-жартылай фрагментине комплементарлык ырааттуулук катары долбоорлоого болот, андан кийин тескери транскрипция учурунда максаттуу miRNA өзөк-укурук ырааттуулугуна туташтырылышы мүмкүн жана жалпы узундугу 70bp жетиши мүмкүн, бул qPCR тарабынан аныкталган күчөтүлгөн продуктунун узундугуна ылайык келет.Tailing miRNA праймер дизайны.
Күчөтүү үчүн атайын аныктоо:
Онлайн жардыруу базасы: ырааттуулугу боюнча CottonFGD жардыруу
Жергиликтүү жарылуу: Жергиликтүү жардыруу үчүн Blast+ колдонууну караңыз, Linux жана macos түздөн-түз жергиликтүү маалымат базасын түзө алат, win10 тутумун ubuntu bash орноткондон кийин да жасоого болот.Жергиликтүү жардыруу маалыматтар базасын жана жергиликтүү жардырууларды түзүү;win10 боюнча ubuntu bash ачыңыз.
Эскертүү: Тоолуу пахта жана деңиз аралынын пахтасы тетраплоиддүү өсүмдүктөр болуп саналат, андыктан жарылуунун натыйжасы көбүнчө эки же андан көп дал келет.Мурда, NAU компакт-дисктерин жардыруу үчүн маалымат базасы катары колдонуу, бир нече SNP айырмачылыктары бар эки гомологдук генди табышы мүмкүн.Адатта, эки гомологдук генди праймер дизайны менен бөлүүгө болбойт, ошондуктан аларга бирдей мамиле кылынат.Эгерде ачык-айкын индел бар болсо, праймер, адатта, инделде иштелип чыккан, бирок бул праймердин экинчилик структурасына алып келиши мүмкүн. Эркин энергия жогорулап, күчөтүү эффективдүүлүгүнүн төмөндөшүнө алып келет, бирок бул сөзсүз болот.

Баштапкы экинчи структураны аныктоо:
Кадамдар:олиго 7 ачуу → киргизүү шаблонунун ырааттуулугу → суб-терезени жабуу → сактоо → шаблондогу праймерди табыңыз, праймердин узундугун орнотуу үчүн ctrl+D баскычтарын басыңыз → өзүн-өзү димеризациялоочу корпус, гетеродимер, чач кычкач, дал келбегендик, ж.б.у.с ар кандай экинчи структураларды талдоо.Алдыңкы праймердин натыйжасы жакшы, ачык dimer жана hairpin түзүлүшү жок, үзгүлтүксүз кошумча негиздер жок жана бош энергиянын абсолюттук мааниси 4,5тен аз, ал эми арткы праймер үзгүлтүксүз көрсөтөт.Мындан тышкары, 3′ аягында бир кыйла олуттуу dimer пайда болуп, 4 ырааттуу негиздер бир dimer пайда болот.Эркин энергия жогору болбосо да, 3′ dimer Chl күчөтүү өзгөчөлүгүнө жана күчөтүү натыйжалуулугуна олуттуу таасир этиши мүмкүн.Мындан тышкары, чач тактарды, гетеродимерлерди жана дал келбестигин текшерүү керек.

Fig3 oligo7 аныктоо натыйжалары
Күчөтүү натыйжалуулугун аныктоо:
ПЦР реакциясынын күчөтүү эффективдүүлүгү ПТР натыйжаларына олуттуу таасирин тийгизет.Ошондой эле qRT-ПЧРда күчөтүү эффективдүүлүгү сандык натыйжалар үчүн өзгөчө маанилүү.Реакция буфериндеги башка заттарды, машиналарды жана протоколдорду алып салыңыз.Праймерлердин сапаты да qRT-PCRдин күчөтүү эффективдүүлүгүнө чоң таасирин тийгизет.Натыйжалардын тактыгын камсыз кылуу үчүн салыштырмалуу флуоресценттик сандык жана абсолюттук флуоресценттик сандык аныктоо праймерлердин күчөтүү эффективдүүлүгүн аныктоосу керек.Бул натыйжалуу qRT-PCR күчөтүү натыйжалуулугу 85% жана 115% ортосунда экени таанылган.Эки ыкма бар:
1. Стандарттык ийри сызык ыкмасы:
а.cDNA аралаштыруу
б.Градиент суюлтуу
c.qPCR
г.Күчөтүүнүн эффективдүүлүгүн эсептөө үчүн сызыктуу регрессия теңдемеси
2. LinRegPCR
LinRegPCR бул реалдуу убакытта RT-PCR маалыматтарын талдоо үчүн программа, ошондой эле SYBR Green же окшош химиянын негизинде сандык ПТР (qPCR) маалыматтары деп аталат.Программа базалык эмес түзөтүлгөн маалыматтарды колдонот, ар бир үлгүдөгү базалык оңдоону өзүнчө жүргүзөт, сызыктуулуктун терезесин аныктайт жана андан кийин ПТР маалымат топтому аркылуу түз сызыкты тууралоо үчүн сызыктуу регрессиялык анализди колдонот.Бул сызыктын эңкейишинен ар бир жеке үлгүнүн ПТР эффективдүүлүгү эсептелет.Ампликонго ПТРдин орточо эффективдүүлүгү жана ар бир үлгүдөгү Ct мааниси ыктыярдуу флуоресценция бирдиктеринде чагылдырылган үлгүдөгү баштапкы концентрацияны эсептөө үчүн колдонулат.Маалыматтарды киргизүү жана чыгаруу Excel электрондук жадыбалында.Жөн гана үлгү
аралаштыруу талап кылынат, эч кандай градиент
кадамдар талап кылынат:(Мисалы катары Bole CFX96ны алалы, так ABI менен машина эмес)
эксперимент:бул стандарттуу qPCR эксперименти.
qPCR маалымат чыгаруу:LinRegPCR чыгуу файлдарынын эки формасын тааный алат: RDML же сандык Күчөтүү натыйжасы.Чынында, бул машина тарабынан цикл номерин жана флуоресценттик сигналдын реалдуу убакытта аныктоо мааниси жана күчөтүү сызыктуу сегменттин эффективдүүлүгүнүн флуоресценттик өзгөрүү маанисин талдоо жолу менен алынат.
Маалымат тандоо: Теорияда, RDML мааниси колдонууга жарактуу болушу керек.Менин компьютеримдин көйгөйү программалык камсыздоо RDMLди тааный албагандыгы, андыктан менде баштапкы маалыматтар катары excel чыгаруу мааниси бар.Адегенде маалыматтарды одоно скринингден өткөрүү сунушталат, мисалы үлгүлөрдү кошуунун бузулушу ж.

Fig5 qPCR маалыматтарды экспорттоо

Fig6 талапкер үлгүлөрдү тандоо

Маалымат киргизүү:Квалификацияны күчөтүү натыйжаларын ачыңыз.xls, → LinRegPCRди ачыңыз → файл → excelден окуу → 7-сүрөттө көрсөтүлгөндөй параметрлерди тандаңыз → OK → базалык көрсөткүчтөрдү аныктоону басыңыз

linRegPCR маалыматтарды киргизүүнүн Fig7 кадамдары

Натыйжа:Кайталоо жок болсо, анда эч кандай топтоо талап кылынбайт.Эгерде кайталоо бар болсо, анда топтоштурууну үлгүлөрдү топтоодо оңдоого болот, ал эми гендин аты идентификаторго киргизилет, андан кийин ошол эле ген автоматтык түрдө топтолот.Акыр-аягы, файлды чыкылдатып, excelди экспорттоп, натыйжаларды көрүңүз.Ар бир скважинанын күчөтүү эффективдүүлүгү жана R2 натыйжалары көрсөтүлөт.Экинчиден, эгер сиз топторго бөлүнсөңүз, оңдолгон орточо күчөтүү эффективдүүлүгү көрсөтүлөт.Ар бир праймердин күчөтүү эффективдүүлүгү 85% жана 115% ортосунда болушун камсыз кылыңыз.Эгер ал өтө чоң же өтө кичине болсо, бул праймердин күчөтүү эффективдүүлүгү начар экенин билдирет.

Fig 8 Натыйжа жана маалыматтарды чыгаруу

Эксперименттик процесс:
РНК сапатына талаптар:
Тазалык:1.72.0 калдык изотиоцианат болушу мүмкүн экенин көрсөтүп турат.Таза нуклеиндик кислота A260/A230 2 тегерегинде болушу керек .230 нм күчтүү жутуу бар болсо, ал phenate иондору сыяктуу органикалык кошулмалар бар экенин көрсөтүп турат.Мындан тышкары, аны 1,5% агароз гел электрофорез менен аныктоого болот.Маркерди көрсөтүңүз, анткени ssRNA денатурациясы жок жана молекулярдык салмак логарифминин сызыктуу байланышы жок, молекулярдык салмакты туура көрсөтүү мүмкүн эмес.Концентрация: теориялык жактанжок100нг/улдан аз, эгерде концентрация өтө төмөн болсо, тазалыгы көбүнчө төмөн эмес, бийик эмес

Fig9 РНК гели

Мындан тышкары, эгерде үлгү баалуу жана РНК концентрациясы жогору болсо, аны экстракциялоодон кийин аликводоштуруу жана РНКны кайра транскрипциялоо үчүн 100-300 нг/ул акыркы концентрациясына чейин суюлтуу сунушталат.Inтескери транскрипция процесси, mRNA транскрипцияланганда, тескери транскрипция үчүн полиА куйруктары менен атайын байланыша алган олиго (dt) праймерлер колдонулат, ал эми lncRNA жана circRNA жалпы РНКнын тескери транскрипциясы үчүн кокустук гексамерди (Random 6 mer) праймерлерди колдонушат.Көптөгөн ишканалар азыр атайын калдыктарды сактоочу жайларды ишке киргизишти.Өзөк-укурук ыкмасы үчүн калдыктарды сактоо ыкмасы ыңгайлуу, жогорку өтүмдүүлүк жана реагентти үнөмдөөчү, бирок бир үй-бүлөдөгү miRNAларды айырмалоонун эффектиси өзөк-укурук ыкмасы сыяктуу жакшы болбошу керек.Ар бир тескери транскрипция комплекти генге тиешелүү праймерлердин концентрациясына талаптарды камтыйт.miRNA үчүн колдонулган ички шилтеме U6 болуп саналат.Сабактын илмек инверсия процессинде U6 түтүгү өзүнчө тескери бурулуп, U6нын алдыңкы жана арткы праймерлери түз кошулушу керек.circRNA жана lncRNA экөө тең HKGs ички маалымдама катары колдоно алышат.IncDNA аныктоо,
РНК менен эч кандай көйгөй жок болсо, cDNA да жакшы болушу керек.Бирок, эгерде эксперименттин кемчиликсиздиги көздөлсө, анда gDNAны CDден айырмалай ала турган ички маалымдама генди (Reference gen, RG) колдонуу эң жакшы.Жалпысынан алганда, RG үй чарбалык ген болуп саналат., HKG) 10-сүрөттө көрсөтүлгөндөй;Ал убакта мен соя сактоочу протеинди жасап жаткам жана ички маалымдама катары интрондорду камтыган актин7ди колдончумун.Бул праймердин гДНКдагы күчөтүлгөн фрагментинин өлчөмү 452 бит, ал эми cDNA шаблон катары колдонулса, 142 бит болгон.Андан кийин тесттин натыйжалары cDNAнын бир бөлүгү чындыгында gDNA менен булганганын аныктады, ошондой эле тескери транскрипциянын натыйжасы менен эч кандай көйгөй жок экенин далилдеди жана аны ПТР үчүн шаблон катары колдонсо болот.Агароз гели электрофорезин түздөн-түз cDNA менен жүргүзүү пайдасыз жана бул диффузиялык тилке, бул ынандырарлык эмес.

Fig 10 cDNA аныктоо

qPCR шарттарын аныктоокомплекттин протоколуна ылайык, негизинен tm маанисинин кадамында эч кандай көйгөй жок.Эгерде кээ бир праймерлер праймерди долбоорлоодо жакшы иштелип чыкпаса, натыйжада tm мааниси менен теориялык 60°C ортосунда чоң айырма пайда болсо, cDNA үлгүлөрү аралашкандан кийин праймерлер менен градиенттик ПТР жүргүзүү жана TM мааниси катары тилкесиз температураны коюудан качууга аракет кылуу сунушталат.

Маалыматтарды талдоо

Кадимки салыштырмалуу флуоресценттик сандык ПТР иштетүү ыкмасы негизинен 2ге ылайык-ΔΔCT.Маалыматтарды иштетүү үлгүсү.

Тектеш продуктылар:

Real Time PCR Easy^TM – Такман

Real Time PCR Easy^TM –СЫБР ГРИН И

RT Easy I (биринчи катардагы cDNA синтези үчүн Master Premix)

RT Easy II (qPCR үчүн биринчи катардагы cDNA синтези үчүн Master Premix)