Primer дизайн негизи (99% көйгөйлөр чечилиши мүмкүн)
1. Primer узундугу: Окуу китеби 15-30bp талап кылат, адатта болжол менен 20bp.Чыныгы абалы өзгөчөлүгүн камсыз кылуу үчүн 18-24bp болуу жакшы, бирок канчалык узак болсо, ошончолук жакшы, өтө узун праймер да өзгөчөлүгүн азайтат, жана түшүмдүүлүктү азайтат.
2. Primer күчөтүү аралыгы: 200-500bp ылайыктуу, ал эми фрагментти белгилүү бир шарттарда 10кб чейин кеңейтүүгө болот.
3. Primer базасы: G+C мазмуну 40-60% болушу керек, өтө аз G+C күчөтүү эффектиси жакшы эмес, өтө көп G+C өзгөчө эмес тилкелердин пайда болушу оңой.ATGC 5тен ашык пурин же пиримидин нуклеотиддеринин кластерлеринен качуу менен туш келди бөлүштүрүлгөн.Туруктуулукту жогорулатуу үчүн 5′ аягы жана аралык ырааттуулугу үчүн мульти-gc, 3′ аягында бай GC болбоңуз, акыркы 3 база үчүн GC жок же акыркы 5 базанын 3ү үчүн GC жок.
4. Праймерлерде экинчилик структурадан качыңыз жана эки праймердин ортосундагы толуктоодон, өзгөчө 3' аягындагы толуктоодон качыңыз, антпесе праймер димери түзүлүп, спецификалык эмес күчөтүлгөн тилкелер пайда болот.
5. Праймерлердин 3 'учундагы негиздер, айрыкча акыркы жана акыркыдан кийинки базалар жупташтырылбаган терминалдык негиздерден улам ПТР иштебей калбаш үчүн катуу жупталуу керек.
6. Праймерлердин ылайыктуу бөлүү жерлери бар же кошулушу мүмкүн, ал эми күчөтүлгөн максаттуу ырааттуулуктун ылайыктуу бөлүү жерлери болушу керек, бул бөлүүнү талдоо же молекулярдык клондоштуруу үчүн абдан пайдалуу.
7. Праймерлердин өзгөчөлүгү: праймерлердин нуклеиндик кислота ырааттуулугунун маалымат базасында башка тизмектер менен ачык гомологиясы болбошу керек.
8. Программаны колдонууну үйрөнүңүз: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (Бул онлайн дизайн эң жакшы иштейт).
Жогорудагы мазмун праймер дизайн көйгөйлөрүнүн жок дегенде 99% чече алат.
Праймер дизайнынын деталдарын көзөмөлдөө
1. Праймердин узундугу
Праймердин жалпы узундугу 18 ~ 30 базаны түзөт.Жалпысынан, праймердин күйүү температурасын аныктоочу эң маанилүү фактор - бул праймердин узундугу.Праймерди күйдүрүү температурасы жалпысынан тандалат (Tm мааниси -5℃), кээ бирлери түздөн-түз Tm маанисин колдонушат.Төмөнкү формулалар праймерлердин күйүү температурасын болжолдуу эсептөө үчүн колдонулушу мүмкүн.
Праймердин узундугу 20биттен аз болгондо: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
Праймердин узундугу 20биттен жогору болгондо: 62,3℃+0,41℃(%GC)-500/length-5℃
Мындан тышкары, көптөгөн программалык камсыздоону күйгүзүү температурасын эсептөө үчүн колдонсо болот, эсептөө принциби ар кандай болот, ошондуктан кээде эсептелген мааниде бир аз боштук болушу мүмкүн.ПТР реакцияларын оптималдаштыруу үчүн эң жакшы эффективдүү жана өзгөчөлүк үчүн 54℃ кем эмес күйдүрүү температурасын камсыз кылган эң кыска праймерлер колдонулат.
Жалпысынан, праймердин өзгөчөлүгү ар бир кошумча нуклеотид үчүн төрт эсеге көбөйөт, андыктан көпчүлүк колдонмолор үчүн праймердин минималдуу узундугу 18 нуклеотидди түзөт.Праймердин узундугунун жогорку чеги өтө маанилүү эмес, негизинен реакциянын эффективдүүлүгүнө байланыштуу.Энтропиядан улам, праймер канчалык узун болсо, ал ДНК полимеразанын байланышы үчүн туруктуу эки тилкелүү шаблонду түзүү үчүн максаттуу ДНК менен байланыштыруу ылдамдыгы ошончолук төмөн болот.
Праймерлерди долбоорлоо үчүн программалык камсыздоону колдонууда, праймерлердин узундугу кезеги менен TM мааниси менен аныкталышы мүмкүн, өзгөчө флуоресценттик сандык ПТРдин праймерлери үчүн, TM=60℃ же башкасын көзөмөлдөө керек.
2.GC мазмуну
Негизинен, праймер тизмегиндеги G+C мазмуну 40% ~ 60% түзөт, ал эми GC мазмуну жана бир жуп праймердин Tm мааниси координацияланышы керек.Эгерде праймер олуттуу GC же AT тенденциясына ээ болсо, праймердин 5 'учуна A, T же G жана C куйругунун тиешелүү көлөмүн кошууга болот.
3. Күйүү температурасы
Жылдыруу температурасы чынжырдан чыгуу температурасынан 5℃ төмөн болушу керек.Эгерде праймер негиздеринин саны аз болсо, күйдүрүү температурасын тийиштүү түрдө жогорулатууга болот, бул ПТРдин өзгөчөлүгүн жогорулатат.Негиздердин саны көп болсо, күйгүзүү температурасы тиешелүү түрдө азайтылышы мүмкүн.4℃ ~ 6℃ жуп праймерлердин ортосундагы күйдүрүү температурасынын айырмасы ПТР түшүмүнө таасир этпейт, бирок идеалдуу түрдө жуп праймерлердин күйдүрүү температурасы бирдей, ал 55℃ ~ 75℃ ортосунда өзгөрүшү мүмкүн.
4. Күчөтүү шаблонунун экинчи структурасынын аймагынан алыс болуңуз
Күчөтүлгөн фрагментти тандоодо калыптын экинчилик структурасынын аймагынан качуу жакшы.Максаттуу фрагменттин стабилдүү экинчи структурасын болжолдоо жана тиешелүү компьютердик программалык камсыздоо менен баалоого болот, бул шаблонду тандоо үчүн пайдалуу.Эксперименттик жыйынтыктар кеңейтилүүчү аймактын бош энергиясы (△G) 58,6кДж/мольден аз болгондо, кеңейүү көбүнчө ийгиликсиз болоорун көрсөтүп турат.
5. Максаттуу ДНК менен дал келбөө
Күчөтүлгөн максаттуу ДНК ырааттуулугу чоң болгондо, праймер максаттуу ДНКнын бир нече бөлүктөрү менен байланышып, натыйжада бир нече тилке пайда болушу мүмкүн.Бул жолу BLAST программалык камсыздоону тестирлөө, веб-сайтты колдонуу керек:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Эки тизмекти тегиздөө (bl2seq) тандаңыз.
Праймер ырааттуулугун 1-зонага жана максаттуу ДНК ырааттуулугун 2-зонага чаптоо бири-бирин алмаштырууга болот жана BLAST комплементарлык, антисенстик жана башка мүмкүнчүлүктөрдү эсептейт, ошондуктан колдонуучулар эки чынжыр тең сезүү чынжырчасы экенин байкашпайт.Эгер сиз маалымат базасындагы ырааттуулуктун GI номерин билсеңиз, GI номерин да киргизсеңиз болот, андыктан ырааттуулуктун чоң бөлүгүн чапташтыруунун кереги жок.Акырында, праймерде максаттуу ДНКда бир нече гомологдук сайттар бар же жок экенин көрүү үчүн 3 боюнча тегиздөө баскычын чыкылдатыңыз.
6. Праймер терминалы
Праймердин 3 'аягы узартуу башталат, ошондуктан дал келбестиктердин ошол жерден башталышын алдын алуу маанилүү.3 'аягы 3 ырааттуу G же Сдан ашпашы керек, анткени бул G+C байытуу ырааттуулугунун аймагында праймердин жаңылыш иштетилишине алып келет.3' учу кандайдыр бир экинчилик структураны түзө албайт, атайын ПТР (AS-PCR) реакцияларынан тышкары, праймердин 3' учу туура келбейт.Мисалы, эгер коддоочу аймак күчөтүлгөн болсо, праймердин 3 'аягы кодондун үчүнчү позициясында токтотулбашы керек, анткени кодондун үчүнчү позициясы бузулууга жакын, бул күчөтүүнүн өзгөчөлүгүнө жана эффективдүүлүгүнө таасирин тийгизет.Аннексия праймерлерин колдонгондо, кодонду колдонуу таблицасына кайрылыңыз, биологиялык артыкчылыктарга көңүл буруңуз, 3′ аягында аннексия праймерлерин колдонбоңуз жана праймерлердин жогорку концентрациясын (1uM-3uM) колдонуңуз.
7. Праймерлердин экинчилик түзүлүшү
Праймерлердин өзүндө кошумча ырааттуулук болбошу керек, антпесе, праймерлердин өзүлөрү бүктөлүп, чач кычкач структураларына айланат жана бул экинчилик структура стерикалык тоскоолдуктан улам праймерлердин жана шаблондордун байланышына таасирин тийгизет.Эгерде жасалма баалоо колдонулса, праймерлердин үзгүлтүксүз толуктоочу негиздери 3bp ашпоого тийиш.Эки праймердин ортосунда эч кандай толуктоо болбошу керек, өзгөчө 3 'учтун кошумча бири-бирине дал келишин алдын алуу үчүн праймер димерлеринин пайда болушуна жол бербөө керек.Жалпысынан, бир жуп праймердин ортосунда 4 ырааттуу негиздер гомологиясы же толукталышы болбошу керек.
8. Маркерлерди же локустарды кошуңуз
5 'аягы күчөтүү өзгөчөлүгүнө анча деле таасир этпейт жана ошондуктан күчөтүү өзгөчөлүгүнө таасир этпестен өзгөртүлүшү мүмкүн.5-праймердин аягынын модификациясы төмөнкүлөрдү камтыйт: ферментти чектөө сайтын кошуу;Белгиленген биотин, флуоресцент, дигоксин, Eu3+, ж.б. Белокторду байланыштырган ДНК ырааттуулугун киргизүү;Мутация участокторун киргизүү, мутациянын ырааттуулугун киргизүү жана жок кылуу жана промоторлордун ырааттуулугун киргизүү ж.б.у.с. Кошумча негиздер күчөтүүнүн эффективдүүлүгүнө аздыр-көптүр таасирин тийгизет жана праймер димеринин пайда болуу мүмкүнчүлүгүн жогорулатат, бирок кийинки кадам үчүн кээ бир жеңилдиктерди жасоо керек.Чектөө сайттары жана промоутер ырааттуулугу сыяктуу максаттуу ырааттуулукта жок кошумча ырааттуулуктарды праймердин 5′ учуна өзгөчөлүгүнө таасир этпестен кошууга болот.Бул ырааттуулуктар праймердин Tm маанилерин эсептөөдө камтылган эмес, бирок толуктоо жана ички экинчилик түзүлүш үчүн текшерилиши керек.
9. Субклондор
Көпчүлүк учурда, ПТР алдын ала клондоштуруу болуп саналат, андан кийин биз максаттуу фрагментти ар кандай векторлорго субклондообуз керек, ошондуктан ПТР кадамында кийинки операция үчүн кошумча базаларды иштеп чыгышыбыз керек.
Субклондоо үчүн иштелип чыккан кээ бир ырааттуулуктар төмөндө жалпыланган.
Чектөө эндонуклеаза чектөө сайты кошулду
Ферментти чектөө сайттарын кошуу ПТР продуктуларын субклондоо үчүн эң көп колдонулган ыкма.Жалпысынан алганда, бөлүү сайт алты база болуп саналат, 5 'аягына кошумча 2 ~ 3 коргоочу негиздери кошуу керек.Бирок ар кандай ферменттер талап кылган коргоочу негиздердин саны ар башка.Мисалы, SalⅠ коргоочу базаны талап кылбайт, EcoRⅤ 1 коргоочу базаны, NotⅠ үчүн 2 коргоочу базаны жана Hind Ⅲ үчүн 3 коргоочу негизди талап кылат.
LIC куйругун кошот
LIC толук аталышы - Ligation-Independent клондоо, Навоген тарабынан атайын pET векторунун бир бөлүгү үчүн ойлоп табылган клондоо ыкмасы.LIC ыкмасы менен даярдалган pET ташуучунун кошумча эмес 12-15 негиздүү бир жиптүү жабышчаак учтары бар, алар максаттуу кыстаруу фрагментиндеги тиешелүү жабышчаак учтарды толуктайт.Күчөтүү максатында киргизилген фрагменттин праймер 5′ ырааттуулугу LIC векторун толуктап турушу керек.T4 ДНК полимеразанын 3′→5′ экстранекттик активдүүлүгү кыска убакыттан кийин киргизилген фрагментте бир жипче жабышчаак учун пайда болушу мүмкүн.Продукт даярдалган кыстаруу фрагментин жана векторду өз ара күйдүрүүдөн гана түзүлүшү мүмкүн болгондуктан, бул ыкма абдан тез жана эффективдүү, ал багытталган клондоштуруу болуп саналат.
Багытталган ТА клону куйрук кошуу
ТА клондоо фрагментти векторго багыттай алган жок, ошондуктан кийинчерээк Invitrogen клондоштурууну бутага ала турган векторду киргизди, анын бир четинде төрт көрүнүктүү GTGGS базасы бар.Ошондуктан, ПТР праймерлерин долбоорлоодо, фрагменттер “багытталган” болушу үчүн, ошого жараша кошумча ырааттуулуктарды кошуу керек.
Эгерде сизде убакыт жетишсиз болсо, анда генди вектор менен айкалыштыруу менен түз синтезди сынап көрсөңүз болот, муну биз музекуляристтерде ET ген синтези деп атайбыз.
D. In-Fusion клондоо ыкмасы
Лигаза талап кылынбайт, узак реакция талап кылынбайт.Сызыктуу вектордун эки учундагы ырааттуулук Праймерлерди долбоорлоодо киргизилгенде, андан кийин ПТР продуктусу жана сызыктуу вектор BSA камтыган эритмедеги ферменттин эритмесине кошулуп, жарым саатка бөлмө температурасында жайгаштырылат, трансформация жүргүзүлүшү мүмкүн.Бул ыкма өзгөчө чоң көлөмдөгү конверсия үчүн ылайыктуу.
10. Примерди бириктирүү
Кээде, праймер дизайны жөнүндө чектелген ырааттуулук маалыматы гана белгилүү.Мисалы, бир гана аминокислота тизмеги белгилүү болсо, бириктирүүчү праймерди долбоорлоого болот.Биригүү праймери бир аминокислотаны коддогон ар кандай базалык мүмкүнчүлүктөрдү чагылдырган ар кандай тизмектердин аралашмасы.Өзгөчөлүгүн жогорулатуу үчүн, ар кандай организмдердин базалык колдонуу артыкчылыктарына ылайык аннексияны азайтуу үчүн кодонду колдонуу таблицасына кайрылсаңыз болот.Гипоксантинди бардык негиздер менен жупташтырып, праймердин күйүү температурасын төмөндөтсө болот.Праймердин 3′ учундагы тиркелген негиздерди колдонбоңуз, анткени 3′ учундагы акыркы 3 негизди күйдүрүү туура эмес жерде ПТРди баштоо үчүн жетиштүү.Көптөгөн аннексия аралашмаларындагы праймерлер максаттуу калыпка мүнөздүү болбогондуктан, праймерлердин жогорку концентрациясы (1μMден 3μM) колдонулат.
ПЦР чийки затконтролдоо
1. Праймердин саны
Ар бир праймердин концентрациясы 0,1 ~ 1умоль же 10 ~ 100поль.Керектүү натыйжаны эң аз өлчөмдөгү праймер менен берген жакшы.Праймердин жогорку концентрациясы дал келбегендикти жана спецификалык эмес күчөтүүнү пайда кылат жана праймерлердин ортосунда димерлердин пайда болуу мүмкүнчүлүгүн жогорулатат.
2. Праймердин концентрациясы
Примерлердин концентрациясы өзгөчөлүгүнө таасир этет.Оптималдуу праймер концентрациясы жалпысынан 0,1 жана 0,5μM ортосунда.Жогорку праймер концентрациялары спецификалык эмес продуктулардын күчөшүнө алып келет.
3. Праймерди күйгүзүү температурасы
Праймерлер үчүн дагы бир маанилүү параметр эрүү температурасы (Тм) болуп саналат.Бул праймерлердин жана толуктоочу тизмектердин 50% кош тилкелүү ДНК молекулалары катары көрсөтүлгөн температура.Tm ПЦР күйгүзүү температурасын орнотуу үчүн талап кылынат.Идеалында, күйдүрүү температурасы праймерлердин максаттуу ырааттуулугу менен эффективдүү күйгүзүлүшүн камсыз кылуу үчүн жетиштүү төмөн, бирок спецификалык эмес байланышты азайтуу үчүн жетиштүү.55 ℃ дан 70 ℃ чейин акылга сыярлык күйгүзүү температурасы.Күйүү температурасы негизинен праймердин Tm дан 5℃ төмөн коюлат.
Tm орнотуунун бир нече формулалары бар, алар колдонулган формулага жана праймерлердин ырааттуулугуна жараша чоң өзгөрөт.Көпчүлүк формулалар болжолдуу Tm маанисин бергендиктен, бардык күйгүзүү температуралары башталгыч чекит гана болуп саналат.Өзгөчөлүктү күйүү температурасын акырындык менен жогорулаткан бир нече реакцияларды талдоо аркылуу жакшыртууга болот.Болжолдуу Tm-5℃ден төмөн баштап, акырындык менен күйдүрүү температурасын 2℃ кадам менен жогорулатыңыз.Жогорку күйдүрүү температурасы праймердик димерлердин жана спецификалык эмес продуктулардын пайда болушун азайтат.Эң жакшы натыйжалар үчүн, эки праймердин болжолдуу Tm маанилери болушу керек.Эгерде праймер жуптарынын Tm айырмасы 5℃ ашса, циклде төмөнкү күйгүзүү температурасын колдонуу менен праймерлер олуттуу жалган башталышын көрсөтөт.Эгерде эки праймер Tm башка болсо, күйдүрүү температурасын эң төмөнкү Tmден 5℃ төмөн коюңуз.Же болбосо, өзгөчөлүктү жогорулатуу үчүн, адегенде жогорку Tm үчүн эсептелген күйдүрүү температураларында беш цикл, андан кийин төмөнкү Tm үчүн иштелип чыккан күйдүрүү температураларында калган циклдер аткарылышы мүмкүн.Бул катуу шарттарда көздөгөн шаблондун жарым-жартылай көчүрмөсүн алууга мүмкүндүк берет.
4. Праймердин тазалыгы жана туруктуулугу
Колдонуучу праймерлердин стандарттуу тазалыгы ПТР колдонмолорунун көбү үчүн адекваттуу.Бензойл жана изобутилил топторун тузсуздандыруу жолу менен жок кылуу минималдуу жана ошондуктан ПТРге тоскоолдук кылбайт.Кээ бир колдонмолор синтез процессинде толук эмес ырааттуулуктарды жок кылуу үчүн тазалоону талап кылат.Бул кыскартылган тизмектер ДНК синтезинин химиясынын эффективдүүлүгү 100% болбогондуктан пайда болот.Бул 3′тен 5′ке чейин ДНКны түзүү үчүн ар бир база кошулган сайын кайталанган химиялык реакцияларды колдонгон тегерек процесс.Сиз эки циклде да ийгиликсиз болушуңуз мүмкүн.Узунураак праймерлер, айрыкча 50 негиздерден ашкандар, кесилген ырааттуулуктун чоң үлүшүнө ээ жана тазалоону талап кылышы мүмкүн.
Праймерлердин түшүмдүүлүгүнө синтетикалык химиянын эффективдүүлүгү жана тазалоо ыкмасы таасир этет.Биофармацевтикалык компаниялар, мисалы, Cytology жана Shengong, олигонуклеозиддердин жалпы өндүрүшүн камсыз кылуу үчүн минималдуу OD бирдигин колдонушат.Жеке праймерлер кургак порошок түрүндө жөнөтүлөт.Акыркы концентрациясы 100μM болушу үчүн ТЭде праймерлерди кайра эритүү эң жакшы.TE деионизацияланган сууга караганда жакшыраак, анткени суунун рНы көбүнчө кислоталуу жана олигонуклеозиддердин гидролизине алып келет.
Праймерлердин туруктуулугу сактоо шарттарына жараша болот.Кургак порошок жана эриген праймерлерди -20℃ температурада сактоо керек.ТЭде 10μМден жогору концентрацияда эриген праймерлерди -20℃ температурада 6 ай туруктуу сактоого болот, бирок бөлмө температурасында (15℃ден 30℃ге чейин) 1 жумадан азыраак сактоого болот.Кургак порошок праймерлерин -20 С температурада 1 жылдан кем эмес жана бөлмө температурасында (15 С дан 30 С) 2 айга чейин сактоого болот.
5. Ферменттер жана алардын концентрациясы
Азыркы учурда, колдонулган Taq ДНК полимераза негизинен колиформ бактериялар тарабынан синтезделген ген инженердик энзим болуп саналат.Кадимки ПТР реакциясын катализдөө үчүн зарыл болгон ферменттин көлөмү болжол менен 2,5U (100ул реакциянын жалпы көлөмүн билдирет).Эгерде концентрация өтө жогору болсо, анда ал спецификалык эмес күчөтүүгө алып келиши мүмкүн;эгерде концентрация өтө төмөн болсо, синтетикалык продуктунун көлөмү азаят.
6. dNTP сапаты жана концентрациясы
dNTP сапаты концентрациясы жана ПТР күчөтүү натыйжалуулугу менен тыгыз байланышта.dNTP порошок гранул болуп саналат, ал туура эмес сакталган болсо, анын өзгөргүчтүк биологиялык ишин жоготот.dNTP эритмеси кислота болуп саналат жана жогорку концентрацияда, 1M NaOH же 1M Tris.HCL буфердик эритмеси менен анын PH 7,0 ~ 7,5ке чейин жөндөө үчүн колдонулушу керек, аз өлчөмдөгү суб-пакеттер, тоңдурулган сактоо -20℃.Бир нече тоңдуруу-эритүү dNTP начарлатат.ПТР реакциясында dNTP 50 ~ 200umol/L болушу керек.Айрыкча, төрт DNTPS концентрациясына көңүл буруш керек (бирдей моль даярдоо).Эгерде алардын кайсы биринин концентрациясы башкаларынан (жогорку же төмөн) айырмаланса, дал келбестик пайда болот.Өтө төмөн концентрация ПЦР продукциясынын түшүмүн төмөндөтөт.dNTP Mg2+ менен биригип, эркин Mg2+ концентрациясын азайта алат.
7. Шаблон (максаттуу ген) нуклеиндик кислота
Калыптын нуклеиндик кислотасынын өлчөмү жана тазалоо даражасы ПТРдин ийгилиги же ийгиликсиз болушу үчүн негизги шилтемелердин бири болуп саналат.ДНКны тазалоонун салттуу ыкмалары, адатта, үлгүлөрдү сиңирүү жана жок кылуу үчүн SDS жана протеаза К колдонушат.СДСтин негизги функциялары: клетка мембранасында липиддерди жана белокторду эритет, ошентип мембраналык белокторду эритип клетка мембранасын жок кылат жана клеткадагы ядролук белокторду диссоциациялайт, SDS да белоктор менен биригип, чөктүрө алат;Протеаза К протеиндерди, айрыкча ДНК менен байланышкан гистондорду гидролиздеп, сиңире алат, андан кийин белокторду жана башка клетка компоненттерин бөлүп алуу үчүн органикалык эриткич фенолду жана хлороформду колдоно алат, ал эми нуклеин кислотасын тунатуу үчүн этанол же изопропил спиртин колдоно алат.Алынган нуклеин кислотасы ПТР реакциялары үчүн шаблон катары колдонулушу мүмкүн.Жалпы клиникалык аныктоо үлгүлөрү үчүн тез жана жөнөкөй ыкманы клеткаларды эритүү, патогендерди лизаттоо, сиңирүү жана протеиндерди хромосомалардан эркин максаттуу гендерге алып салуу жана ПТР күчөтүү үчүн түздөн-түз колдонсо болот.РНК үлгүсүн экстракциялоо, адатта, РНКны деградациялоосуна жол бербөө үчүн гуанидин изоцианат же протеаза К ыкмасын колдонот.
8.Mg2+ концентрациясы
Mg2+ ПЦР күчөтүүнүн өзгөчөлүгүнө жана түшүмдүүлүгүнө олуттуу таасир этет.Жалпы ПТР реакциясында ар кандай dNTP концентрациясы 200umol/L болгондо, Mg2+ тиешелүү концентрациясы 1,5 ~ 2,0 ммоль/л болот.Mg2+ концентрациясы өтө жогору, реакциянын өзгөчөлүгү төмөндөйт, спецификалык эмес күчөтүү пайда болот, өтө төмөн концентрация Так ДНК полимеразанын активдүүлүгүн төмөндөтөт, натыйжада реакция продуктулары азаят.
Магний иондору ПТРдин бир нече аспектилерине таасир этет, мисалы, ДНК полимераза активдүүлүгү, бул түшүмдүүлүккө таасир этет;Дагы бир мисал, өзгөчөлүккө таасир этүүчү праймерди күйгүзүү.dNTP жана шаблон магний ионуна байланып, ферменттин активдүүлүгү үчүн зарыл болгон эркин магний ионунун көлөмүн азайтат.Оптималдуу магний ионунун концентрациясы ар кандай праймер жуптары жана шаблондору үчүн өзгөрөт, бирок 200μM dNTP менен типтүү ПТР баштапкы концентрациясы 1,5 мм (эскертүү: реалдуу убакыттагы сандык ПТР үчүн флуоресценттик зонд менен 3-5мМ магний ионунун эритмесин колдонуңуз).Эркин магний иондорунун жогорку концентрациясы түшүмдү жогорулатат, бирок ошол эле учурда спецификалык эмес күчөтүүнү жогорулатат жана ишенимдүүлүктү төмөндөтөт.Оптималдуу концентрацияны аныктоо үчүн магний ионунун титрлөөлөрү 1мМден 3мМге чейин 0,5мМ кадам менен аткарылган.магний ион оптималдаштыруу боюнча көз карандылыкты азайтуу үчүн, Platinum Taq ДНК полимераза колдонулушу мүмкүн.Platinum Taq ДНК полимераза Taq ДНК полимеразага караганда магний ионунун кеңири диапазонунда функцияны сактай алат жана ошондуктан азыраак оптималдаштырууну талап кылат.
9. Pcr көмөкчү кошумчалар
Күйүү температурасын, праймердин дизайнын жана магний ионунун концентрациясын оптималдаштыруу көпчүлүк калыптардын жогорку спецификалык күчөтүлүшү үчүн жетиштүү;бирок кээ бир калыптар, анын ичинде GC мазмуну жогору, кошумча чараларды талап кылат.ДНКнын эрүү температурасына таасир этүүчү кошумчалар продуктунун өзгөчөлүгүн жана түшүмдүүлүгүн жакшыртуунун дагы бир жолун камсыз кылат.Мыкты натыйжаларга жетиш үчүн шаблонду толук денатурациялоо талап кылынат.
Мындан тышкары, экинчи структурасы праймердин байланышын жана ферменттин узартылышын алдын алат.
ПТР кошумчалары, анын ичинде формамид, DMSO, глицерин, бетаин жана PCRx Enhancer Solution, күчөтүүнү күчөтөт.Алардын мүмкүн болгон механизми эрүү температурасын төмөндөтүү, ошентип, праймерлерди күйгүзүүгө жардам берүү жана экинчи структуралык аймак аркылуу ДНК полимеразанын узартылышына жардам берүү.PCRx Solution башка артыкчылыктарга ээ.Platinum Taq ДНК полимераза жана Platinum Pfx ДНК полимераза менен колдонулганда минималдуу магний ионун оптималдаштыруу талап кылынат.Ошентип, Platinum ыкмасы үчүнчү ыкма, магний ион оптималдаштыруу көз карандылыкты азайтуу, ал эми өзгөчөлүгүн жогорулатуу үчүн кошумча менен айкалыштырылган.Эң жакшы натыйжаларга жетишүү үчүн кошумчалардын концентрациясын оптималдаштыруу керек, өзгөчө Так ДНК полимеразасын тоскоол кылган DMSO, формамид жана глицерол.
10. Кызуу баштоо
Hot start ПТР жакшы праймер дизайнынан тышкары ПТР өзгөчөлүгүн жакшыртуу үчүн эң маанилүү ыкмалардын бири болуп саналат.Taq ДНК полимеразанын оптималдуу узартуу температурасы 72 ℃ болсо да, полимераз бөлмө температурасында активдүү бойдон калууда.Ошентип, спецификалык эмес продуктулар ПТР реакциясын даярдоодо жана жылуулук циклинин башталышында кармоонун температурасы күйдүрүү температурасынан төмөн болгондо чыгарылат.Түзүлгөндөн кийин, бул спецификалык эмес продуктулар эффективдүү түрдө күчөтүлөт.Праймерди долбоорлоо үчүн колдонулган сайттар генетикалык элементтердин жайгашкан жери менен чектелген учурда ысык баштоо ПТР өзгөчө эффективдүү болот, мисалы сайтка багытталган мутациялар, экспрессиялык клондошуу же ДНК инженериясы үчүн колдонулган генетикалык элементтерди куруу жана манипуляциялоо.
Так ДНК полимеразанын активдүүлүгүн чектөөнүн кеңири таралган ыкмасы музда ПТР реакциясынын эритмесин даярдоо жана аны алдын ала ысытылган ПТР аппаратына коюу болуп саналат.Бул ыкма жөнөкөй жана арзан, бирок ал ферменттин активдүүлүгүн аягына чыгарбайт жана ошондуктан спецификалык эмес продуктулардын күчөшүн толугу менен жок кылбайт.
Термикалык прайминг ПЦР аппараты денатурация температурасына жеткенге чейин маанилүү компонентти ингибирлөө аркылуу ДНК синтезин кечеңдетет.Көпчүлүк кол менен термикалык баштоо ыкмалары, анын ичинде Taq ДНК полимеразанын кечиктирилген кошуусу, айрыкча, жогорку өндүрүмдүүлүгү бар колдонмолор үчүн түйшүктүү.Башка термикалык праймердик методдор магний иондорун же ферменттерин камтыган маанилүү компонентти жабуу үчүн же шаблондор жана буферлер сыяктуу реактивдүү компоненттерди физикалык жактан изоляциялоо үчүн мом калканчты колдонушат.Термикалык цикл учурунда ар кандай компоненттер бөлүнүп чыгат жана мом эрип жатканда аралашат.Кол менен ысык баштоо ыкмасы сыяктуу эле, мом калкан ыкмасы оор жана булганууга жакын жана жогорку өткөрүү жөндөмдүүлүгүнө ылайыктуу эмес.
Платина ДНК полимеразасы ПЦРди автоматтык түрдө баштоо үчүн ыңгайлуу жана натыйжалуу.Platinum Taq ДНК полимераза Так ДНК полимеразага каршы моноклоналдык антитело менен бириккен рекомбинантты Так ДНК полимеразасынан турат.Антителолор температураны узак кармап туруу учурунда ферменттердин активдүүлүгүн токтотуу үчүн ПТР тарабынан түзүлөт.Так ДНК полимераза денатурация баскычын 94℃ изоляциялоо учурунда реакцияга чыгарылып, полимераздын толук активдүүлүгүн калыбына келтирет.Термикалык баштоо үчүн химиялык жактан өзгөртүлгөн Taq ДНК полимеразасынан айырмаланып, платина ферменти полимеразаны активдештирүү үчүн 94℃ (10-15 мүнөт) узакка созулган изоляцияны талап кылбайт.PlatinumTaq ДНК полимеразасы менен Taq ДНК полимераза активдүүлүгүнүн 90% 94℃де 2 мүнөттөн кийин калыбына келтирилди.
11. Nest-PCR
Уюшкан праймерлерди колдонуу менен кезектеги күчөтүү раунддары өзгөчөлүктү жана сезгичтикти жакшыртат.Биринчи раунд 15тен 20га чейин стандарттык күчөтүү болуп саналат.Баштапкы күчөтүү продуктунун кичине бөлүгү 100дөн 1000ге чейин суюлтулган жана 15тен 20га чейинки цикл үчүн күчөтүүнүн экинчи айлампасына кошулган.Же болбосо, баштапкы күчөтүлгөн продукт гелди тазалоо менен өлчөнгөн болушу мүмкүн.Уяланган праймер күчөтүүнүн экинчи айлампасында колдонулат, ал биринчи праймердин ичиндеги максаттуу ырааттуулук менен байланыша алат.Уюшкан ПТРди колдонуу бир нече максаттуу сайттарды күчөтүү мүмкүнчүлүгүн азайтат, анткени праймерлердин эки топтомун тең толуктаган максаттуу тизмектер аз.Ошол эле праймерлер менен циклдердин бирдей жалпы саны (30дан 40ка чейин) спецификалык эмес жерлерди күчөттү.Уюшкан ПТР чектелген максаттуу тизмектердин (мисалы, сейрек кездешүүчү mrnas) сезгичтигин жогорулатат жана кыйын PCRSтин өзгөчөлүгүн жакшыртат (мисалы, 5′ RACE).
12. Төмөндөгү ПТР
Төмөндөгү ПТР ПТРдин алгачкы бир нече циклдери үчүн катуу күйгүзүү шарттарын колдонуу менен өзгөчөлүктү жакшыртат.Цикл болжолдонгон Tmден болжол менен 5℃ жогору күйдүрүү температурасында башталат, андан кийин ар бир цикл 1℃ дан 2℃ га төмөндөтүлөт, күйдүрүү температурасы Tm 5℃ төмөн болгонго чейин.Эң жогорку гомологиясы бар көздөгөн жердин үлгүсү гана күчөтүлөт.Бул продуктылар кийинки циклдерде кеңейип, күчөтүлгөн спецификалык эмес өнүмдөрдү жокко чыгарат.Төмөндөгү ПТР праймер менен максаттуу шаблондун ортосундагы гомологиянын даражасы белгисиз болгон ыкмалар үчүн пайдалуу, мисалы, AFLP ДНК манжа изин изилдөө.
Тиешелүү ПТР топтомдору
2 × ПТР баатырыTMМикс системасы кадимки ПТР Микс системасына караганда ПТР ингибиторлоруна толеранттуулукка ээ жана ар кандай татаал калыптардын ПТР күчөтүүсүнө оңой туруштук бере алат.Уникалдуу реакция системасы жана жогорку эффективдүү Taq Hero ПТР реакциясын күчөтүү эффективдүүлүгүнө, өзгөчөлүгүнө жана сезгичтигине ээ кылат.
Жогорку күчөтүү натыйжалуулугу
Ал 5'→3' ДНК полимераза активдүүлүгүнө жана 5'→3' экзонуклеаза активдүүлүгүнө ээ, 3'→5' экзонуклеаза активдүүлүгү жок.
Real Time PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Спецификалык - оптималдаштырылган буфер жана ысык баштоо Taq ферменти спецификалык эмес күчөтүүнү жана праймер димеринин пайда болушун алдын алат
Жогорку сезгичтик — шаблондун аз көчүрмөлөрүн аныктай алат
Комплект уникалдуу Foregene тескери транскрипция реагентин жана Foregene HotStar Taq ДНК Полимеразасын уникалдуу реакция системасы менен бирге күчөтүү эффективдүүлүгүн жана реакциянын өзгөчөлүгүн натыйжалуу жакшыртуу үчүн колдонот.
Посттун убактысы: 09-май 2023-ж
