RT-qPCR эксперименти РНКны экстракциялоо жана сапатты баалоо, тескери транскрипция жана qPCR үч кадамды камтыйт, ар бир кадамда көптөгөн сактык чаралары бар, биз төмөндө кеңири тааныштырабыз.

Ⅰ.РНК сапатын баалоо

RT-qPCR экспериментинде, РНКны экстракциялоо аяктагандан кийин, РНКнын сапатын баалоо керек жана кийинки эксперимент квалификациялангандан кийин гана жүргүзүлүшү мүмкүн.Баалоо ыкмаларына спектрофотометр, Agilent гел электрофорези, Agilent 2100 анализи кирет, алардын арасында эң көп колдонулган спектрофотометр жана агароз гел электрофорез ыкмасын аныктоо.РНКнын сапатын камсыз кылуу үчүн РНК концентрациясын, тазалыгын жана бүтүндүгүн аныктоону жана анализин аяктоо үчүн бул эки ыкманы чогуу колдонуу керек экендигин белгилей кетүү керек.

Тектеш РНК изоляциялоо комплекти: 

Клетканын жалпы РНК изоляциясынын комплекти

Жогорку тазаланган жана жогорку сапаттагы жалпы РНКны ар кандай культураланган клеткалардан 11мин ичинде алууга болот.

Жаныбарлардын жалпы РНК изоляциясынын комплекти

Ар кандай жаныбарлардын кыртыштарынан жогорку тазалыктагы жана сапаттуу жалпы РНКны тез жана натыйжалуу чыгарып алыңыз.

Спектрофотометр:

Спектрофотометр негизинен РНКнын концентрациясын жана тазалыгын аныктоо үчүн колдонулат, бирок РНКнын бүтүндүгүн жана геномдук калдыкты аныктай албайт.Алардын арасында, A260/280 жана A260/230 РНК тазалыгын аныктоо үчүн маанилүү параметрлери болуп саналат, ал эми РНК тазалыгын алардын баалуулуктарынын термелүүсүнө жараша аныктоого болот:

1. 1.9< A260/280< 2.1, РНКнын тазалыгы жакшы экенин көрсөтөт;A260/280<1,9, РНКда белок калдыктары болушу мүмкүн экенин көрсөтүү;A260/280>2.1, РНКнын мүмкүн болгон жарым-жартылай бузулушун көрсөтүп турат, аны андан ары агароз гел электрофорези менен ырастоого болот.

2. 2.0< A260/230< 2.2, РНКнын тазалыгы жакшы экенин көрсөтөт;A260/230< 2.0, РНКда фенолдор, этанол же кант сыяктуу органикалык реагенттердин калдыктары болушу мүмкүн экенин көрсөтүп турат.

Агароз гел электрофорези:

Агароздук гел электрофорез анализи РНКнын бүтүндүгүн, геномду жана белок калдыктарын талдай алат, бирок РНКнын концентрациясын так аныктай албайт же органикалык реагенттердин калдыктарын аныктай албайт.Мисалы, эукариоттук РНК шаблондорун алалы:

1. РНК агароз гел электрофорезге дуушар болгон.Гель картасында 28sRNA, 18sRNA жана 5.8sRNAнын үч гана жалгыз тилкеси бар болсо, бул алынган РНКнын бүтүндүгүн көрсөтөт.Эгерде сүйрөө көрүнүшү болсо, бул РНКнын жарым-жартылай бузулушун көрсөтөт.

2. Эгерде клей тешик менен 28sRNA тилкесинин ортосунда бир жаркыраган тилке бар болсо, анда геномдук ДНК калдыктары болушу мүмкүн.

3. Эгерде желим тешигинде тилкелер пайда болсо, бул белоктун жана башка макромолекулярдык заттардын калдыктары болушу мүмкүн экенин көрсөтүп турат.

Ⅱ. Тескери транскрипция

РНКны экстракциялоо аяктагандан кийин, аны кийинки эксперименттер үчүн кДНКга айлантуу керек, ошондуктан тескери кадам абдан маанилүү.Тескери транскрипция тескери транскриптазаны жана праймерди тандоодон киргизилет:

Тескери транскриптаза тандоо:

Кадимки тескери транскриптаздарга AMV RTase жана MMLV RTase кирет.AMV RTaseнын RNase H күчтүү активдүүлүгү, кыска синтез узундугу, аз синтез көлөмү жана жакшы жылуулук туруктуулугу (42 ~ 55 ℃) бар.MMLV RTase RNase H активдүүлүгү начар, синтез узактыгы узун, синтездин көлөмү жогору жана жылуулук туруктуулугу начар (37 ~ 42 ℃).

RNase H ферменти РНК шаблонун деградациялоо функциясына ээ болгондуктан, алсыз RNase H активдүүлүгү бар MMLV тескери транскрипцияда артыкчылыктуу түрдө тандалышы керек жана кийинчерээк гендик инженериядан кийин MMLVнин жылуулук туруктуулугу сапаттык секирикке жетти.Foregene алууБолжолдуу тескери транскриптаза (кайтарым транскрипция үчүн M-MLV) мисал катары, бул генетикалык рекомбинация технологиясын колдонуу менен E. coli инженердик бактерияларда туюнтулган жаңы тескери транскриптаза.Бул бир катарлуу РНКдан, ДНКдан же РНК:ДНК гибридинен комплементарлык ДНК тилкесин синтездөөчү рекомбинантты ДНК полимераза.Ал эч кандай RNase H активдүүлүгүн, күчтүү туруктуулугун, күчтүү РНК жакындыгын жана жогорку аныктоо сезгичтиги бар.

 

Болжолдуу тескери транскриптаза (кайтарым транскрипция үчүн M-MLV)

Праймерди тандоо:

Жалпысынан RT праймерлер үч категорияга бөлүнөт: олиго dT, туш келди праймерлер жана генге тиешелүү праймерлер.Ар кандай эксперименталдык талаптарга ылайык колдонуу үчүн ылайыктуу праймерлерди тандаңыз.

1. Эгерде калып эукариоттук келип чыккан болсо жана кеч cDNA күнүмдүк ПТР күчөтүү үчүн колдонулса, Олиго (dT) сунушталат;Эгерде кийинки эксперимент qPCR үчүн гана колдонулса, Oligo (dT) тескери транскрипциянын натыйжалуулугун жогорулатуу үчүн кокус праймерлер менен аралаштыруу сунушталат.

2. Эгерде шаблон прокариоттордон болсо, тескери транскрипция үчүн Random Primer же генге тиешелүү праймерлер тандалышы керек.

Ⅲ.qPCR

Флуоресценттин сандык көрсөткүчү негизинен сандык ыкмаларды тандоодон, праймерди долбоорлоо принциптеринен, ROX тандоодон, реакция системасынын конфигурациясынан жана реакция шарттарын орнотуудан ж.б.

Сандык ыкмаларды тандоо:

Сандык ыкмалар салыштырмалуу сандык методдор жана абсолюттук сандык методдор болуп бөлүнөт.Салыштырмалуу сандык аныктоо айрым дарылоо ыкмаларынын ген экспрессиясына тийгизген таасирин аныктоо, ген экспрессиясынын ар кандай мезгилдеги айырмасын аныктоо жана ар кандай кыртыштарда ген экспрессиясынын айырмасын салыштыруу үчүн колдонулушу мүмкүн.Абсолюттук сандык аныктоо вирустун курамындагы нуклеин кислотасынын көлөмүн жана башкаларды аныктай алат.Эксперименттерди жасоодо биз өзүбүздүн эксперименттерибизге ылайык тиешелүү сандык ыкмаларды тандап алышыбыз керек.

Праймерди долбоорлоо принциптери:

qPCR үчүн праймердин дизайны күчөтүү эффективдүүлүгүнө жана продуктунун өзгөчөлүгүнө түздөн-түз байланыштуу.Ошондуктан, жакшы праймерлерди туура долбоорлоо ийгиликтүү qPCRдин биринчи кадамы болуп саналат.Примерди долбоорлоодо, кадимки праймерди долбоорлоо принцибине жооп бергенде төмөнкү принциптерге көңүл буруу керек:

1. Максаттуу фрагменттин узундугу 100 жана 300 bp ортосунда көзөмөлдөнөт;

2. геномдук ДНКнын таасирине жол бербөө үчүн экзон аралык дизайн;

3. Долбоорланган праймерлерди күчөтүү эффективдүүлүгүн текшерүү керек жана күчөтүү эффективдүүлүгү стандартка жеткенде гана (90-110%) аларды сандык эксперименттер үчүн колдонууга болот;

4. Primer концентрациясы, адатта, 0.1uM жана 1.0uM ортосунда оптималдаштырылган.

ТандооROX:

Сандык реакция процессинде ROX оптикалык жолдун айырмасын, пиптинг катасын же буулануу жана конденсациядан келип чыккан көлөмдүн айырмасын бирдей жөнгө салып, натыйжалардын кайталануу мүмкүнчүлүгүн жакшыртат.Бирок, ROX тандоо аспапка байланыштуу экенин белгилей кетүү керек.qPCR аспабы тешиктердин ортосундагы айырманы автоматтык түрдө оңдоо функциясына ээ болсо, ROX кошуунун кереги жок;антпесе, ROX түзөтүүсүн кошуу керек.Реагенттерди сатып алууда чакан өнөктөштөр туура ROX тандоо үчүн колдонулган аспапка ылайык болушу керек, кийин ката кетирбөө керек.

Реакция системасын даярдоо:

Реакциянын көлөмү 20ул жана 50ул.Системаны түзүүдө төмөнкү маселелерге көңүл буруу керек:

1. Реакция системасы ультра таза жумушчу столдо желдетүү жолу менен даярдалышы керек, жаңы ddH₂О ар бир эксперимент үчүн колдонулат;

2. Ар бир эксперимент системада булгануу бар-жоктугун текшерүү үчүн NTC даярдашы керек, ал эми ар бир жуп праймер системаны даярдоодо NTC жасашы керек;

3. РНК шаблонунда гДНК калдыктары бар же жок экенин аныктоо үчүн, NRT аныктоо үчүн ар бир үлгү үчүн даярдалышы мүмкүн;

4. Системаны даярдоодо бир үлгү үчүн кеминде 3 техникалык кайталоону жасоо сунушталат;

5. Калып cDNA болгондо, qPCR экспериментинде тескери транскрипция системасынын бөгөт коюу таасирин азайтуу үчүн 5-10 жолу суюлтуу сунушталат.Калыптын санын градиент боюнча изилдеген жакшы, андыктан КТ мааниси 20-30га чейин түшөт;

6. Реакциялардын керектүү санын аныктап, реакциялардын санына жараша 5-10% көбөйтүп, көлөмдүн конфигурация номерин эсептегиле;

7, система премикс принцибинин жардамы менен даярдалат, центрифугалоодон кийин аралаштыруу жана көбүктөрдүн болбошун камсыз кылуу;

8, Мүмкүн болушунча колдоочу материалдарды тандоо.

Тиешелүү RT-qPCR комплекти