аныктоонун өзгөчөлүгү

Көпчүлүк учурларда, праймерди долбоорлоонун максаты ПТРдин өзгөчөлүгүн жогорулатуу болуп саналат.Бул көптөгөн өзгөрмөлөрдүн аздыр-көптүр болжолдуу таасири менен аныкталат.Маанилүү өзгөрмөлөрдүн бири - праймердин 3′ аягындагы ырааттуулук.

Маанилүү нерсе, өзгөчөлүк үчүн иштелип чыккан ПТР анализдери кеңири динамикалык диапазондо жогорку эффективдүүлүктү сактап калуу ыктымалдыгы жогору, анткени анализ спецификалык эмес күчөтүү продуктуларын чыгарбайт, ошону менен ПЦР реагенттери менен атаандашат же негизги күчөтүү реакциясын бөгөттөйт.

Албетте, кээ бир учурларда өзгөчөлүк эң маанилүү эмес, мисалы, максат бири-бири менен тыгыз байланышкан, бирок ар кандай патогендик микроорганизмдердин санын аныктоо болгондо, атайын дизайн, оптималдаштыруу жана текшерүү стандарттары талап кылынат.

Эрүү ийри сызыгы ампликондордун өзгөчөлүгүн баалоо үчүн стандарттык метод, жок дегенде бир максатты күчөтүү керекпи деген шартта.Бирок, баса белгилеп кетүү керек, эрүү ийри сызыктары адаштырышы мүмкүн, анткени, мисалы, аларга субоптималдуу праймерлердин жана шаблондун төмөн концентрацияларынын биргелешкен эффектилери таасир этиши мүмкүн.

P5 |Эрүү ийри сызыгы эки максаттуу ДНКнын ар кандай өлчөмдөгү эки аныктоосунан алынган Tm жылыштарын көрсөтөт.

A. Жогорку концентрацияларда (ad)), qPCR өлчөө аяктагандан кийин эч кандай айкын праймер димери жок.Калыптын концентрациясы 50 нускага чейин азайган сайын (e), спецификалык эмес продукт пайда боло баштайт жана эң төмөнкү концентрацияда (f) жалгыз продукт болуп калат.

B. Сыноо бардык максаттуу концентрацияларда бирдей Tms жазылган жана эң төмөнкү концентрацияда (5 нускада) эч кандай айкын праймер димери болгон эмес.Бул эки аныктоо ыкмасын колдонууда, NTCs эч кандай күчөтүү продуктулары табылган жок.

P5 шаблон ар кандай концентрацияда болгон үлгүлөр менен алынган эрүү ийри сызыктарын көрсөтөт.Р 5а эң төмөнкү эки концентрацияда өндүрүлгөн спецификалык эмес күчөтүү продуктуларынын Tms өзгөчө ампликондордон төмөн экенин көрсөтүп турат.

Албетте, бул аныктоо ыкмасы аз концентрацияда бар максаттарды аныктоо үчүн ишенимдүү түрдө колдонулушу мүмкүн эмес.

Кызыктуусу, NTCs, башкача айтканда, ДНКсы такыр жок үлгүлөр (спецификалык эмес) күчөтүү продуктуларын жазышкан жок, бул фондук геномдук ДНК спецификалык эмес амплификацияга/полимеризацияга катыша аларын көрсөтүп турат.

Кээде мындай фон праймерлерин жана спецификалык эмес күчөтүүнү оңдоо мүмкүн эмес, бирок көбүнчө кандайдыр бир калыптын концентрациясында жана NTC (P 5b) спецификалык эмес күчөтүүсүнө ээ болбогон аныктоо ыкмасын долбоорлоого болот.

Бул жерде, Cq 35 менен максаттуу концентрациянын күчөшүн жазуу да белгилүү бир эрүү ийри сызыгын пайда кылат.Ошо сыяктуу эле, NTCs өзгөчө эмес күчөтүү белгилерин көрсөткөн.Кээде аныктоо жүрүм-туруму энелик ичимдиктен көз каранды болушу мүмкүн жана айрым буфердик курамдарда спецификалык эмес күчөтүү гана аныкталат, ал ар кандай Mg2+ концентрацияларына байланыштуу болушу мүмкүн.

аныктоо туруктуулугу

Ta оптималдаштыруу эмпирикалык текшерүү жана qPCR аныктоо оптималдаштыруу жараянында пайдалуу кадам болуп саналат.Ал НТКны күчөтпөстөн эң төмөнкү Cq пайда кылган температураны (же температуралык диапазонду) көрсөтүү менен орнотулган праймердин бекемдигин түз көрсөтүүнү камсыз кылат.

Сезгичтиктин экиден төрт эсеге чейинки айырмасы mRNA экспрессиясы жогору адамдар үчүн маанилүү болбошу мүмкүн, бирок диагностикалык тесттер үчүн бул оң жана жалган терс натыйжалардын ортосундагы айырманы билдириши мүмкүн.

qPCR праймерлеринин Ta касиеттери абдан ар түрдүү болушу мүмкүн.Кээ бир сыноолор өтө күчтүү эмес жана эгерде алар праймерлердин оптималдуу Ta маанисинде аткарылбаса, алар тез эле кыйрап калат.

Бул маанилүү, анткени аныктоонун бул түрү көбүнчө реалдуу дүйнөдө көйгөй жаратат жана үлгүнүн тазалыгы, ДНКнын концентрациясы же башка ДНКнын болушу оптималдуу эмес болушу мүмкүн.

Мындан тышкары, максаттуу көчүрмөнүн саны кеңири диапазондо ар кандай болушу мүмкүн жана реагенттер, пластик идиштер же инструменттер тестти орнотууда колдонулгандан башкача болушу мүмкүн.

P6|Температура градиенти ПТР аныктоонун ар кандай бекемдигин көрсөтөт.

A. Адам мээсинин РНКсынан даярдалган cDNA боюнча ПТР жүргүзүү үчүн Bioline's Sensifast SYBR мастермиксин (каталог номери BIO-98050) колдонуңуз.

B. Апалендин күчөтүү картасын жана эрүү ийри сызыгын жазуу үчүн Bio-Radдын CFX qPCR аспапты колдонуңуз (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG).

C. ACSBG1дин күчөтүү графиги жана эрүү ийри сызыгы (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).

D. GFAPтын күчөтүү графиги жана эрүү ийри сызыгы (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCTCGTGGATCTTC).

E. Cqs 7C температура градиентинин астында жазылган Cq ​​айырмасын көрсөтүү, ар кандай күйдүрүү температурада жазылган.

P 6 жагымсыз тесттин типтүү жыйынтыгын көрсөтөт, мында qPCR 59C жана 67C (P 6a) ортосундагы Tas градиентинин жардамы менен аткарылган, үч адамдын мээсине тиешелүү үч ген үчүн праймерлерди колдонуу.

Күчөтүү графигинен Opalin праймерлери идеалдан алыс экенин көрүүгө болот, анткени алардын оптималдуу Ta диапазону абдан тар (6б-сүрөт), башкача айтканда, Cq кеңири таралган, натыйжада Cq алардын оптималдуу Cqs Төмөнүнө салыштырмалуу олуттуу түрдө байкалат.

Бул аныктоо ыкмасы туруксуз жана субоптималдуу күчөтүүгө алып келиши мүмкүн.Ошондуктан, бул жуп праймерди кайра иштеп чыгуу керек.Кошумчалай кетсек, эрүү ийри сызыгынын анализи (киргизилген) бул аныктоо ыкмасынын өзгөчөлүгү да көйгөйлүү болушу мүмкүн экенин көрсөтүп турат, анткени ар бир Ta эрүү ийри сызыгы ар башка.

P 6c-де көрсөтүлгөн ACSBG1 аныктоо ыкмасы жогорудагы Opalin аныктоо ыкмасына караганда күчтүү, бирок ал дагы эле идеалдан алыс жана аны өркүндөтсө болот.

Бирок, биз бекемдик менен өзгөчөлүктүн ортосунда эч кандай зарыл байланыш жок экенин баса белгилейбиз, анткени бул аныктоо ыкмасы менен өндүрүлгөн эрүү ийри сызыгы бардык Tas (киргизилген) бирдей чоку маанисин көрсөтөт.

Башка жагынан алганда, бекемдик тести P 6d көрсөтүлгөн GFAP сынагында болгондой, Tasтын кеңири диапазонунда окшош Cqs өндүрүү, алда канча сабырдуу.

Ошол эле 8 градус Цельсий диапазонунда алынган Cq ​​айырмасы 1ден аз жана эрүү ийри сызыгы (киргизилген) бул температура диапазонундагы аныктоо мүнөздөмөлөрүн ырастайт.Белгилей кетчү нерсе, эсептелген Tas жана чыныгы Ta диапазону такыр башкача болушу мүмкүн.

Изилдөөчүлөргө эффективдүү праймерлерди иштеп чыгууга жардам берүү үчүн иштелип чыккан көптөгөн көрсөтмөлөр бар, алардын көбү көптөн бери калыптанып калган эрежелерге негизделген жана праймерлердин 3′ аягына көп көңүл бурулган.Көбүнчө 3' аягында G же С жана эки G же C негизин (GC кысгыч) кошуу сунушталат, бирок акыркы 5 негиздин экөөнөн ашпоого тийиш.

Иш жүзүндө, бул эрежелер изилдөөчүлөрдү жетектей алат, бирок алар бардык шарттарда сөзсүз түрдө туура эмес.

P7 |Праймердин 3′аягы өзгөчөлүккө же эффективдүүлүккө анча деле таасир этпейт.

A. Адамдын HIF-1α (NM_181054.2) гени үчүн праймерлердин абалы.

B. Agilent Brilliant III SYBR Green эне ичимдигин (кат. № 600882) алты тесттик тапшырманы күчөтүү үчүн колдонуңуз.

C. Bio-Radдын CFX qPCR аспабы жана 3′ соңку праймерлер тарабынан жазылган күчөтүү графиги жана эрүү ийри сызыгы.NTCs кызыл менен көрсөтүлгөн.

D. Ар бир тесттин Cqs жазуусу

Мисалы, P 7 натыйжасы 3′аягы эрежесине карама-каршы келет.Бардык конструкциялар негизинен бирдей натыйжаларды берет, эки гана праймер айкалышы NTCде спецификалык эмес күчөтүүгө алып келет.

Бирок, биз GC клипинин эффектин колдой албайбыз, анткени бул учурда A же T максимум 30 негиз катары колдонуу өзгөчөлүктү азайтпайт.

F праймери GGCC менен аяктаган C тести NTCлерде Cq жаздырды, бул 30-аягында бул ырааттуулуктардан качууну каалаарын көрсөттү.Праймер жуптарынын эң жакшы 3′ соңундагы ырааттуулугун аныктоонун жалгыз жолу бул кээ бир талапкер праймерлерди эксперименталдык түрдө баалоо экенин баса белгилейбиз.

Күчөтүү натыйжалуулугу

Маанилүү нерсе, спецификалык эмес ПТР аныктоо эч качан спецификалык боло албаса да, күчөтүү эффективдүүлүгүн энзимди, энелик суюктукту, кошумчаларды жана цикл шарттарын өзгөртүү менен ар кандай жолдор менен жөнгө салууга жана максималдуу жогорулатууга болот.

ПЦР аныктоонун эффективдүүлүгүн баалоо үчүн максаттуу нуклеиндик кислотадан 10 же 5 эсе көп сериялык суюлтууну, башкача айтканда, “стандарттык ийри сызык ыкмасын” колдонуу эң жакшы.

Эгерде ПТР ампликондору же синтетикалык ДНК буталары стандарттуу ийри сызыкты түзүү үчүн колдонулса, бул максаттардын сериялык суюлтуулары ДНКнын фонунун туруктуу көлөмү менен (мисалы, геномдук ДНК) аралаштырылышы керек.

P8 |ПЦР эффективдүүлүгүн баалоо үчүн суюлтуу ийри сызыгы.

A. HIF-1 үчүн праймерлерди колдонуңуз: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA жана R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC жана Agilent's Brilliant III SYBR Green мастермикси (каталог номери 600882) ПТР жана эрүү ийри сызыгы үчүн.

B. 100 нг РНК тескери транскрипцияланган, 2 жолу суюлтулган жана сериялык суюлтулган cDNA үлгүлөрү 1 нг адамдын геномдук ДНКсына 5 жолу суюлтулган.Эрүү ийри сызыгы инсетада көрсөтүлгөн.

C. RT реакциясы, суюлтуу жана сериялык суюлтуу экинчи cDNA үлгүсү үчүн кайталанды жана натыйжалар окшош болду.

P 8 эки башка cDNA үлгүлөрүндө бирдей аныктоо ыкмасын колдонуу менен эки стандарттуу ийри сызыгын көрсөтөт, натыйжасы бирдей эффективдүүлүк, болжол менен 100%, жана R2 мааниси да окшош, башкача айтканда, эксперименталдык маалыматтар менен регрессия сызыгынын ортосундагы дал келүү даражасы же маалыматтар Сызыктуулуктун даражасы.

Эки стандарттуу ийри сызыктарды салыштырууга болот, бирок так бирдей эмес.Эгерде максат максаттуу сандык көрсөткүчтү так аныктоо болсо, анда белгисиздикти түшүндүрбөстөн көчүрмөнүн санын эсептөөнү берүүгө жол берилбестигин белгилей кетүү керек.

P9 |Стандарттык ийри сызыкты колдонуу менен сандык аныктоо менен байланышкан өлчөө белгисиздиги.

A. ПТР жана эрүү ийри шарттарын аткаруу үчүн GAPDH (NM_002046) үчүн праймерлерди колдонуңуз.F: ACAGTTGCCATGTAGACC жана R: TAACTGGTTGAGCACAGG жана Bioline's Sensifast SYBR мастермикси (каталог номери BIO-98050).

B. Bio-Rad's CFX qPCR аспабы менен жазылган күчөтүү диаграммасы, эрүү ийри сызыгы жана стандарттык ийри сызык.

C. Стандарттык ийри сызык графиги жана 95% ишеним аралыгы (CI).

D. Суюлтуу ийри сызыгынан алынган үч Cq маанисинин көчүрмөлөрүнүн саны жана 95% ишеним аралыгы.

P 9 оптималдаштырылган тест үчүн бир стандарттуу ийри сызыктын мүнөздүү өзгөрмөлүүлүгү болжол менен 2 эсе (95% ишеним аралыгы, минимумдан максимумга чейин) болоорун көрсөтөт, бул күтүүгө мүмкүн болгон эң кичине өзгөрмө болушу мүмкүн.

Тектеш продукт:

Cell Direct RT qPCR комплекти

Mouse Tail Direct PCR комплекти

Animal Tissue Direct PCR комплекти