Пипеткалардын учтарын жана EP түтүктөрүн стерилдөө ж.б.
1. Деионизацияланган суу менен 0,1% (миңден бир) DEPC (өтө уулуу зат) даярдап, аны түтүн капотуна кылдаттык менен колдонуп, 4°C жарыктан алыс сактаңыз;
DEPC суу DEPC менен тазаланган жана жогорку температура жана жогорку басым менен стерилденген таза суу болуп саналат.RNase, DNase жана протеиназа жок экендиги текшерилген.
2. Пипетка учу менен EP түтүгүн 0,1% DEPC салып, пипетка учу менен EP түтүгү 0,1% DEP менен толтурулганын текшериңиз.
3. Жарыктан сактаңыз, тик туруңуз (12-24 саат)
4. Учу жана EP түтүгү бар кутучаны DEPCге чылап коюунун кереги жок.Учтагы же EP түтүкчөсүндөгү DEPC суусун болжол менен алып салгандан кийин, аны пакетке салып, ороп алыңыз.
5. 121 градус Цельсий, 30мин
6. 180 градус Цельсий, бир нече саат кургак (кеминде 3 саат)
Эскертүү: a.DEPC менен иштөөдө латекс кол каптарды жана маскаларды кийиңиз!б, же DEPC стерилизациясы жок, 130 ℃, 90 мин автоклав (көп лабораториялар жогорку температурада эки жолу стерилдөө)
РНКны экстракциялоо жөнүндө ойлор
Кыртыштын РНК изоляциясынын бузулушунун эки негизги көрүнүшү
РНК деградациясы жана ткандардагы аралашмалардын калдыктары,деградацияга байланыштуу, келгиле, адегенде маданияттуу клеткалардан алынган РНКнын эмне үчүн оңой бузулбагандыгын карап көрөлү.Учурдагы РНКны экстракциялоочу реагенттердин бардыгында RNaseди тез тосуучу компоненттер бар.Маданияттуу клеткаларга лизат кошуп, аны жөн гана аралаштырыңыз, бардык клеткалар лизат менен кылдат аралаштырылышы мүмкүн, жана клеткалар толугу менен лизис болот.Клеткалар лизистен кийин лизаттын активдүү ингредиенттери дароо клетка ичиндеги РНазаны ингибирлейт, ошондуктан РНК бүтүн бойдон калат.Башкача айтканда, өстүрүлгөн клеткалар лизат менен оңой жана толук байланышта болгондуктан, алардын РНКсы оңой бузулбайт;экинчи жагынан, кыртыштагы РНК оңой бузулат, анткени кыртыштагы клеткалар лизат менен тез байланышта болушпайт.жетиштүү байланыш менен шартталган.Ошентип,РНКнын активдүүлүгүнө бөгөт коюу менен тканды бир клеткага айландыруунун бир жолу бар деп ойлосок, деградация маселеси толугу менен чечилиши мүмкүн.
Суюк азот менен майдалоо эң эффективдүү мындай ыкма.Бирок, суюк азот тегирмен ыкмасы, өзгөчө үлгүлөрдүн саны көп болгондо, абдан түйшүктүү болуп саналат.Бул кийинки эң жакшы нерсени пайда кылды: гомогенизатор.Theгомогенизаторметод клеткалар лизат менен байланышта болгонго чейин RNase активдүүлүгү кантип тоскоол болот деген суроону карабайт, тескерисинче, ткандардын бузулуу ылдамдыгы клетка ичиндеги RNase RNди деградациялоо ылдамдыгынан тезирээк болушун тилейт.
Электр гомогенизатордун эффектиси жакшыраак,жана айнек гомогенизатордун таасири начар, бирок жалпысынан гомогенизатор ыкмасы бузулуу көрүнүшүн алдын ала албайт.Ошондуктан, эгерде экстракция бузулса, суюк азот менен майдалоо үчүн оригиналдуу электр гомогенизатору колдонулушу керек;оригиналдуу айнек гомогенизаторду электрдик гомогенизаторго алмаштыруу же суюк азот менен түздөн-түз тегирменге алуу керек.Көйгөй дээрлик 100% ишке ашат.чечилет.
Кийинки эксперименттерге таасир этүүчү ыпластык калдыктардын көйгөйү деградацияга караганда ар түрдүү себептерге ээ жана ошого жараша чечимдер да ар түрдүү.Аягында,кыртышта бузулуу же калдык калдыктар бар болсо, конкреттүү эксперименталдык материал үчүн экстракция ыкмасы/реагент оптималдаштырылышы керек.Оптималдаштыруу үчүн баалуу үлгүлөрүңүздү колдонуунун кажети жок: базардан балык/тоок сыяктуу майда жаныбарларды сатып алып, РНКны бөлүп алуу үчүн материалдын тиешелүү бөлүгүн, ал эми белокту бөлүп алуу үчүн башка бөлүгүн – ооз, ашказан жана ичеги экстракт менен майдаласаңыз болот.
Алынган РНКнын максаттуу РНКсы ар кандай кийинки эксперименттер үчүн колдонулат жана анын сапатка талаптары ар башка
cDNA китепканасынын курулушу ферменттик реакция ингибиторлорунун калдыктары жок РНКнын бүтүндүгүн талап кылат;Түндүк РНКнын жогорку бүтүндүгүн жана ферменттик реакция ингибиторлорунун калдыктарына төмөнкү талаптарды талап кылат;RT-PCR өтө жогорку РНК бүтүндүгүн талап кылбайт,бирок ферменттик реакцияларды токтотот.Калдыктарга талаптар катуу.Киргизүү чыгарууну аныктайт;максат эң жогорку тазалыктагы РНКны алуу болгон сайын, ал элге жана акчага чыгым болот.
Үлгүлөрдү чогултуу/сактоо
Деградацияга таасир этүүчү факторлор Үлгү тирүү организмден/же баштапкы өсүү чөйрөсүнөн чыккандан кийин үлгүдөгү эндогендик ферменттер РНКны бузуп баштайт,жана бузулуу ылдамдыгы эндогендик ферменттердин мазмунуна жана температурага байланыштуу.Адатта, эндогендик ферменттин активдүүлүгүн толугу менен токтотуунун эки гана жолу бар: лизатты дароо кошуп, кылдат жана тез гомогенизациялоо;кичинекей бөлүктөргө кесип, дароо суюк азот менен тоңдуруу.Эки ыкма тең тез операцияны талап кылат.Акыркысы бардык үлгүлөр үчүн ылайыктуу, ал эми биринчиси клеткалардын жана эндогендик ферменттердин аз мазмуну жана гомогенизациясы оңой болгон ткандарга гана ылайыктуу.Тактап айтканда, өсүмдүк ткандары, боор, боор, уйку бези, көк боор, мээ, май, булчуң ткандары жана башкалар улантуудан мурун суюк азот менен тоңдурулганы жакшы.
Үлгүлөрдү фрагментациялоо жана гомогенизациялоо
Деградацияга жана түшүмдүүлүккө таасир этүүчү факторлор Үлгүнүн фрагментациясыкылдат гомогенизациялоо үчүн, бул РНКны толук жана толук чыгаруу үчүн.Клеткаларды сындырбастан түз гомогенизациялоого болот.Кыртыштарды сынгандан кийин гана гомогендештирүүгө болот.Ачыткылар жана бактериялар гомогендештирилгенге чейин тиешелүү ферменттер менен талкаланышы керек.Төмөнкү эндогендик ферменттер жана гомогенизациялоо оңой болгон ткандарды гомогенизатордун жардамы менен лизатта бир убакта майдалап, гомогендештирүүгө болот;өсүмдүк ткандары, боор, тимус, уйку бези, көк боор, мээ, май, булчуң ткандары жана башка үлгүлөр, Алар эндогендик ферменттерде көп же оңой гомогендештирилбейт,ошондуктан кыртыштын бузулушу жана гомогенизациясы өзүнчө жүргүзүлүшү керек.Фрагментациянын эң ишенимдүү жана эң өндүрүмдүүлүгү суюк азот менен майдалоо, ал эми гомогенизациянын эң ишенимдүү ыкмасы – электрдик гомогенизаторду колдонуу.Суюк азот менен майдалоо жөнүндө өзгөчө эскертүү: үлгү бүт майдалоо процессинде эритилбеши керек, анткени тоңдурулганда эндогендик ферменттер көбүрөөк иштеши мүмкүн.
Лизат тандоо
Иштин ыңгайлуулугуна жана калдык эндогендик аралашмалардын факторлоруна таасир этүүчү Көбүнчө колдонулган лизис эритмелери RNase активдүүлүгүн дээрлик токтото алат.Ошондуктан, лизис чечим тандоодо негизги пункт тазалоо ыкмасы менен айкалышта карап чыгуу болуп саналат.Бир өзгөчөлүк бар:эндогендик ферменттердин жогорку мазмуну бар үлгүлөр эндогендик ферменттерди инактивациялоо мүмкүнчүлүгүн жогорулатуу үчүн фенолду камтыган лизатты колдонуу сунушталат.
Тазалоо ыкмасын тандоо
Калган эндогендик аралашмаларга таасир этүүчү факторлор, экстракция ылдамдыгы Клеткалар сыяктуу таза үлгүлөр үчүн дээрлик бардык тазалоо ыкмасы менен канааттандырарлык натыйжаларды алууга болот.Бирок башка көптөгөн үлгүлөр үчүн, өзгөчө өсүмдүктөр, боор, бактериялар, ж.б. сыяктуу ыпластыктары жогору болгондор үчүн ылайыктуу тазалоо ыкмасын тандоо өтө маанилүү.Мамычаны центрифугалык тазалоо ыкмасы тез экстракция ылдамдыгына ээ жана РНКнын кийинки ферменттик реакциясына таасир этүүчү кирлерди эффективдүү түрдө жок кыла алат, бирок бул кымбат (Foregene үнөмдүү комплекттерди сунуштай алат, кененирээк маалымат чыкылдатуубул жерде);LiCl жаан сыяктуу үнөмдүү жана классикалык тазалоо ыкмаларын колдонуу да канааттандырарлык натыйжаларды ала алат, бирок иштөө убактысы узак..
РНК алуу үчүн "Үч дисциплиналар жана сегиз көңүл"
Тартип 1:Экзогендик ферменттердин булганышын токтотуу.
Эскертүү 1:Беткаптарды жана кол каптарды катуу кийиңиз.
Эскертүү 2:Экспериментке тартылган центрифуга түтүктөрүн, Учтун баштарын, пипетка таякчаларын, электрофорез цистерналарын жана эксперименттик отургучтарды кылдат утилдештирүү керек.
Эскертүү 3:Экспериментке тартылган реагенттер/эритмелер, айрыкча суу, RNase жок болушу керек.
2-дисциплинасы:Эндогендик ферменттердин активдүүлүгүн бөгөттөө
Эскертүү 4:Тиешелүү гомогенизация ыкмасын тандаңыз.
Эскертүү 5:Ылайыктуу лизатты тандаңыз.
Эскертүү 6:Үлгүнүн баштапкы көлөмүн көзөмөлдөө.
Тартип 3:Чыгаруу максатыңызды тактаңыз
Эскертүү 7:Кандай гана лизат системасы үлгүнүн максималдуу баштапкы көлөмүнө жакындаганда, казып алуунун ийгилиги кескин төмөндөйт.
Эскертүү 8:Ийгиликтүү РНКны экстракциялоонун бирден-бир экономикалык критерийи түшүмдүүлүк эмес, кийинки эксперименттерде ийгилик болуп саналат.
RNase контаминациясынын эң мыкты 10 булагы
1. Манжалар экзогендик ферменттердин биринчи булагы болуп саналат, ошондуктан кол каптарды кийүү жана тез-тез алмаштыруу керек.Мындан тышкары, маска да кийүү керек, анткени дем алуу да ферменттердин маанилүү булагы болуп саналат.Кол кап кийүүнүн кошумча пайдасы экспериментаторду коргоо болуп саналат.
2. Пипеткалардын учтары, центрифугалык түтүктөр, пипеткалар – RNase стерилдөө жолу менен гана инактивдештирилбейт, андыктан пипеткалардын учтары жана центрифуга түтүктөр DEPC менен иштетилген деп белгиленсе да, DEPC менен дарылоо керек.Атайын пипетканы колдонуу эң жакшы, аны колдонуудан мурун 75% спирттүү кебез менен сүртүңүз, өзгөчө таякчаны;Мындан тышкары, баш тазалоочу каражатты колдонбоңуз.
3. Суу/буфер RNase булгануусу болбошу керек.
4. Сыноо үстөлүн жок дегенде 75% спирт кебездери менен сүртүү керек.
5.Endogenous RNase Бардык кыртыштарда эндогендик ферменттер бар, ошондуктан ткандарды суюк азот менен тез тоңдуруу деградацияны азайтуунун эң жакшы жолу.Суюк азотту сактоо/майдалоо ыкмасы чындап эле ыңгайсыз, бирок бул эндогендик ферменттердин жогорку деңгээли бар кыртыштар үчүн жалгыз жол.
6. РНК үлгүлөрү РНК экстракциясынын продуктуларында RNase булганышынын издери болушу мүмкүн.
7. Плазмиддерди экстракциялоо Плазмиддерди экстракциялоо көбүнчө РНКны деградациялоо үчүн Rnaseди колдонот, ал эми калган Rnase Proteinase K менен сиңирилип, PCI аркылуу алынышы керек.
8. РНКнын сакталышы Төмөнкү температурада сакталган күндө дагы, РНазанын аз өлчөмдөрү РНКнын бузулушуна алып келет.РНКны узак мөөнөттүү сактоо үчүн эң жакшы чечим туз/спирт суспензиясы болуп саналат, анткени спирт төмөнкү температурада бардык ферменттик активдүүлүктү токтотот.
9. Катиондордо (Ca, Mg) бул иондор болгондо, 80С 5 мүнөт ысытуу РНКнын бөлүнүшүнө алып келет, ошондуктан РНКны ысытуу керек болсо, консервалоочу эритмеде хелаттоочу агент (1мМ натрий цитраты, рН 6,4) болушу керек.
10. Кийинки эксперименттерде колдонулган ферменттер RNase менен булганышы мүмкүн.
РНКны экстракциялоо боюнча 10 кеңеш
1: RNase активдүүлүгүн тез алдын алуу.Үлгүлөр чогултулгандан кийин бат тоңдурулат, ал эми RNase лизис учурунда тез операция менен инактивацияланат.
2: жогорку ribozyme мазмуну менен кыртыш үчүн ылайыктуу экстракция ыкмасын тандап, жана майлуу кыртыш фенол камтыган ыкманы колдонуу үчүн жакшы болот.
3: Болжолдоо сапаты Түндүк талап кылат, cDNA китепкана куруу жогорку бүтүндүктү талап кылат жана RT-PCR жана RPA (Ribonuclease коргоо анализ) жогорку бүтүндүгүн талап кылбайт.RT-ПЦР жогорку тазалыкты талап кылат (ферменттердин ингибиторунун калдыктары).
4: Кылдат гомогенизация түшүмдүүлүктү жогорулатуунун жана деградацияны азайтуунун ачкычы болуп саналат.
5: РНК электрофорезди аныктоонун бүтүндүгүн текшерүү, 28S: 18S = 2: 1 - толук белги, 1: 1 да көпчүлүк эксперименттер үчүн алгылыктуу.
6: RT-PCR үчүн ДНКны алып салуу, массивдерди талдоо ДНКны алып салуу үчүн Dnase I колдонуу жакшы.
7: экзогендик энзимдердин булганышын азайтуу - энзимдерди сырттан импорттоо мүмкүн эмес.
8: Төмөн концентрациядагы нуклеин кислотасын концентраттоодо биргелешип чөктүрүүчү реагент кошуу керек.Ал эми энзимдерди жана ДНКнын булганышын камтыган биргелешип преципитантты алдын алуу үчүн.
9: РНКны жакшылап эритип, зарыл болсо, 5 мүнөт 65С ысытыңыз.
ылайыктуу сактоо ыкмасы
Кыска убакытка –20С, ал эми –80С узак мөөнөткө сактоого болот.РНК түшүмдүүлүгүн жакшыртуунун биринчи кадамы ар түрдүү үлгүлөрдүн РНК мазмуну абдан ар түрдүү экенин түшүнүү болуп саналат.Боор, уйку бези, жүрөк сыяктуу жогорку молчулук (2-4гг/мг), мээ, эмбрион, бөйрөк, өпкө, тимус, жумуртка бези сыяктуу орто молчулук (0,05-2г/мг), табарсык, сөөк, май сыяктуу аз молчулук (<0,05уг/мг) мг.
1: РНны чыгаруу үчүн клеткаларды лизис – РНК чыгарылбаса, түшүмдүүлүк азаят.Электр гомогенизациясы башка гомогендөө ыкмаларына караганда жакшыраак иштейт, бирок ошондой эле суюк азотту майдалоо, ферменттик сиңирүү (Лизозим/Литиказа) сыяктуу башка ыкмалар менен айкалыштыруу керек болушу мүмкүн.
2: казып алуу ыкмасын оптималдаштыруу.Фенол негизиндеги ыкмалардын эң чоң көйгөйлөрү – толук эмес катмарлануу жана жарым-жартылай РНК жоготуу (супернатант толугу менен жок кылынышы мүмкүн эмес).Толук эмес катмарлануу нуклеиндик кислотанын жана белоктун көп болушуна байланыштуу, аны лизаттын көлөмүн көбөйтүү же үлгүнүн көлөмүн азайтуу менен чечүүгө болот.Май кыртышына хлороформду экстракциялоо кадамы кошулду.РНКны жоготуу кайра насостоо же органикалык катмарды алып салуу, андан кийин центрифугалоо жолу менен азайтылышы мүмкүн.Мамычаны центрифугалоого негизделген методдордогу эң чоң көйгөй ашыкча үлгү болуп саналат.
Классикалык экстракция боюнча кеңештер
1. Фенолду тазалоо: бирдей көлөмдө 1:1 Фенол/Хлороформ кошуп, 1-2 мүнөт катуу аралаштырыңыз.2 мүнөт жогорку ылдамдыкта центрифугалоо.Этияттык менен үстүн алып салыңыз (80-90%).Эч качан ортоңку катмарга кирбеңиз.Фенол/Хлороформга бирдей көлөмдөгү реакция эритмесин кошуп, үстүнкү затты алып салса болот.Түшүмдүүлүктү жогорулатуу үчүн эки супернатанттарды нуклеиндик кислотаны туташтыруу үчүн аралаштырса болот.Аралаштырууда өтө жумшак болбоңуз жана үстүнкү заттын баарын алып салууга аракет кылбаңыз.
2. 70-80% этанол менен жуу: Жуу учурунда нуклеин кислотасынын калдыктары туздун жуулуп кетишин камсыз кылуу үчүн убактылуу токтотулушу керек.Ошол эле учурда этанолду төккөндөн кийин дароо жогорку ылдамдыкта бир нече секундага центрифугалап, андан кийин калган этанолду пипетка менен алып салыңыз.Бөлмө температурасында 5-10 мүнөт тургандан кийин эритет.
11. Атайын уюмдарды чыгаруу
1. Булалуу кыртыш: жүрөк / скелет булчуң сыяктуу жипчелүү ткандардын РНК алуу ачкычы толугу менен кыртыштын бузуу болуп саналат.Бул ткандардын клетка тыгыздыгы төмөн, ошондуктан ткандын салмагы бирдигине РНКнын саны аз, жана мүмкүн болушунча көп баштапкы сумманы колдонуу жакшы.Тоңдурган шарттарда кыртышты кылдат майдалоону унутпаңыз.
2. Протеин/майы көп кыртыштар: мээ/өсүмдүк майы көп.PCI экстракциясынан кийин супернатанттын курамында ак флоккулалар бар.Үстүңкү затты хлороформ менен кайра экстракциялоо керек.
3. Нуклеин кислотасынын/рибозимдин курамы жогору болгон ткандар: көк боордун/тимус нуклеиндик кислотанын жана рибозимдин жогорку мазмунуна ээ.Тоңдуруу шарттарында кыртыштарды майдалоо, андан кийин тез гомогенизациялоо рибозимдерди эффективдүү түрдө инактивдештире алат.Бирок, эгерде лизат өтө илешкек болсо (нуклеин кислотасынын жогорку мазмунуна байланыштуу), PCI экстракциясы эффективдүү стратификациялана албайт;дагы лизат кошуу бул маселени чече алат.Бир нече PCI экстракциялары көбүрөөк калдык ДНКны алып салышы мүмкүн.Эгерде спирт кошулгандан кийин дароо ак чөкмө пайда болсо, бул ДНКнын булганышын көрсөтөт.Эригенден кийин кислоталуу PCI менен кайра экстракциялоо ДНКнын булганышын жок кыла алат.
4. Өсүмдүк тканы: Өсүмдүк ткандары жаныбарлардын ткандарына караганда татаалыраак.Жалпысынан алганда, өсүмдүктөр суюк азот шарттарында майдаланган, ошондуктан эндогендик ферменттер менен РНК бузулушу сейрек кездешет.Эгерде деградация маселеси чечилбесе, анда ал үлгүдөгү аралашмалар менен шартталган.Көптөгөн өсүмдүктөрдүн курамындагы аралашмалар калдыктарга алып келет, ал эми калдыктардын себеби көбүнчө бул аралашмалардын РНК менен кандайдыр бир окшоштуктары бар: сиз тундурасыз, мен чөктүрөм, а сиз адсорбция кылам, мен адсорбцияланат.Бул өзгөчөлүктөр алардын абдан күчтүү фермент ингибиторлору экенин аныктайт.
Азыркы учурда коммерциялык РНКны экстракциялоочу реагенттерди дээрлик бардык жаныбарлардын кыртыштарына кичине тууралоо менен ыңгайлаштырууга болот, бирок көпчүлүк өсүмдүк ткандарына ылайыктуу болгон коммерциялык РНК экстракциялоочу реагенттер аз.Бактыга жараша, Foregene өзгөчө камсыз кыла алатөсүмдүк РНКсын экстракциялоо комплекттери, бизде барӨсүмдүктөрдүн жалпы РНК изоляциясынын комплекти, Plant Total RNA Isolation Kit Plus.Акыркысы атайын полисахариддин жана полифенолдун жогорку курамы бар өсүмдүктөр үчүн иштелип чыккан.РНКны алуу үчүн лабораториялык колдонуучулардын пикири өзгөчө жакшы.
12. Үлгүлөрдү тоңдуруу жана эритүү эффекти Тоңдурулган үлгү чоңураак болушу мүмкүн жана аны РНКны экстракциялоо үчүн колдонуудан мурун кесүү керек.Үлгүлөр кесүү учурунда эрийт (мүмкүн жарым-жартылай).Тоңдурулган үлгүлөрдү РНКны экстракциялоодон мурун таразалоо керек болушу мүмкүн жана бул процесстин жүрүшүндө эрүү сөзсүз болот.Кээде суюк азотту майдалоо процессинде үлгүнүн эриши да болот;же тоңдурулган үлгү суюк азотту майдалоосуз лизатка түздөн-түз кошулат жана эрүү толук гомогенизацияга чейин сөзсүз болот.Эксперименттер тоңдурулган ткандардын эрүү учурунда РНКнын деградациясына жаңы кыртыштарга караганда көбүрөөк жакын экенин көрсөттү.Мүмкүн болгон себеп: тоңуу-эрүү процесси клетканын ичиндеги структураларды бузуп, эндогендик ферменттердин РНК менен түз байланышын жеңилдетет.
13. РНКнын сапатын баалоо Адатта, РНКнын бүтүндүгүн баалоо үчүн электрофорез, ал эми РНКнын тазалыгын баалоо үчүн A260/A280 колдонулат.Теорияда бузулбаган РНК 28S:18S = 2,7:1 катышына ээ жана көпчүлүк маалыматтарда 28S:18S = 2:1 катышы баса белгиленет.Клеткалардан башка үлгүлөрдөн алынган РНКнын дээрлик эч бири 2:1 катышында эмес (бул Agilent Bioanalyzer аркылуу алынган).
РНКнын электрофорезинин натыйжаларына көптөгөн факторлор таасир этет, анын ичинде экинчилик структура, электрофорездин шарттары, үлгү жүктөмү, EB менен каныккандык даражасы, ж.б. РНКны аныктоо үчүн жергиликтүү электрофорезди колдонуңуз жана ДНК маркерин башкаруу катары колдонуңуз.Эгерде 28S 2kb жана 18S 0,9kb ачык жана 28S: 18S > 1, бүтүндүк көпчүлүк кийинки эксперименттердин талаптарына жооп бере алат.
A260/A280 бир топ башаламандыктарды жараткан көрсөткүч.Биринчиден, нуклеиндик кислоталар үчүн бул көрсөткүчтүн баштапкы маанисин тактоо керек: таза РНК, анын A260/280 = болжол менен 2,0.Таза РНК "себеп" жана A260/A280 = 2 "натыйжа" болуп саналат.Азыр бардыгы A260/A280ди «себеп» катары колдонуп, «эгерде A260/A280 = 2 болсо, анда РНК таза» деп ойлоп жатышат, бул табигый түрдө баш аламандыкка алып келет.
Эгер сизди кызыктырсаңыз, РНК үлгүсүнө фенол, гуанидин-изотиоцианат, PEG ж.б. сыяктуу экстракцияда көп колдонулган бир аз реагент кошуп, андан кийин A260/A280 катышын өлчөсөңүз болот.Чындыгында, РНКны экстракциялоо үчүн колдонулган реагенттердин көбү, ошондой эле үлгүдөгү көптөгөн аралашмалар A260 жана A280дин тегерегинде сиңип, A260/A280ге таасир этет.
Азыркы учурда эң үйрөтүүчү ыкма 200-300 нм диапазондо РНК үлгүлөрүн сканерлөө болуп саналат.Таза РНКнын ийри сызыгы төмөнкүдөй мүнөздөмөлөргө ээ: ийри сызык жылмакай, A230 жана A260 эки ийилүүчү чекит, A300 0гө жакын, A260/A280 = 2,0 жана A260/A230 = 2,0 тегерегинде.Эгерде сканерлөө маалыматтары жок болсо, A260/A230 катышы да аныкталышы керек, анткени бул катыш ферменттик реакцияга таасир этүүчү бардык аралашмалардын өтүшүнө көбүрөөк сезгич.Аппараттын сызыктуу диапазонун эске алыңыз (A260 үчүн 0,1–0,5).
Дагы эки пайдалуу көрүнүш бар: A260/A280 сууда өлчөнгөндө катыш болжол менен 0,3 төмөн болот;ал эми 10 мМ EDTA менен ченелген катыш 1 мМ EDTA менен ченелгенден болжол менен 0,2 жогору.
Тектеш продуктылар:
Кытай Өсүмдүк жалпы РНК изоляция комплект өндүрүүчүсү жана берүүчү |Foregene (foreivd.com)
РНК изоляция сериясы – Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)
Посттун убактысы: 15-июль-2022
