Борбордук догмада РНК ДНК менен белоктун экспрессиясынын ортосундагы транскрипциялык медиатор экени белгилүү.ДНКны аныктоо менен салыштырганда, РНКны аныктоо организмдердеги гендин экспрессиясын объективдүү чагылдыра алат.РНКны камтыган эксперименттерге төмөнкүлөр кирет: qRT-PCR, RNA-Seq жана синтез генин аныктоо, ж.б.. РНКнын өзүнүн өзгөчөлүктөрүнүн негизинде (РНКнын кант шакеги ДНКнын кант шакегине караганда бир көбүрөөк эркин гидроксил тобуна ээ), РНКнын көп сандагы РНКлары менен кошулганда, РНК ДНКга караганда туруксуз жана оңой бузулат.Таштандылар, таштандылар, эгерде РНКнын сапаты жакшы болбосо, анда эксперименттин натыйжалары канааттандырарлык эмес болушу керек, атап айтканда, так эмес маалыматтар же начар кайталануучу катары көрүнүшү керек.Ошондуктан, РНКны кайра иштетүүгө көбүрөөк көңүл буруу керек, сапатты көзөмөлдөө шилтемеси да кийинки эксперименталдык маалыматтардын тактыгын жана тактыгын камсыз кылуу үчүн маанилүү.

РНКнын сапатын контролдоо үчүн жалпысынан төмөнкүдөй кеңири колдонулган ыкмалар бар:

• Спектрофотометрия
• агароз гел электрофорез
• Agilent Bioanalyzer
• реалдуу убакыт флуоресценттик сандык ПТР
• Qubit флуоресценттик боёк ыкмасы

01 Спектрофотометрия

РНК конъюгацияланган кош байланыштарга ээ жана 260нм толкун узундугунда жутуу чокусуна ээ.Ламберт-Бирдин мыйзамына ылайык, биз РНК концентрациясын 260 нм абсорбция чокусунан эсептей алабыз.Мындан тышкары, биз РНКнын тазалыгын 260нм, 280нм жана 230нм жутуу чокуларынын катышына жараша эсептей алабыз.280нм жана 230нм белоктордун жана майда молекулалардын сиңирүү чокулары болуп саналат.Квалификациялуу РНК тазалыгынын A260/A280 жана A260/A230 катышы 2ден чоңураак болушу керек. Эгерде ал 2ден аз болсо, бул РНК үлгүсүндө протеин же чакан молекулалык булгануу бар экенин жана кайра тазалоону талап кылат.Булгануу булактары ПТР реакцияларынын күчөтүү эффективдүүлүгүнө бөгөт коюу сыяктуу ылдыйкы эксперименттерге таасирин тийгизип, так эмес сандык натыйжаларга алып келет.РНКнын тазалыгы кийинки натыйжаларга чоң таасирин тийгизет, ошондуктан спектрофотометрия жалпысынан нуклеин кислоталарынын эксперименттеринин биринчи этабында сапатты көзөмөлдөөнүн зарыл звеносу болуп саналат.

Сүрөт 1. Типтүү РНК/ДНКнын абсорбция спектри

02 Агароз гел электрофорези

Тазалыктан тышкары, РНКнын бүтүндүгү да РНКнын сапатын баалоо үчүн маанилүү көрсөткүчтөрдүн бири болуп саналат.РНКнын деградациясы үлгүдөгү көп сандагы кыска фрагменттердин пайда болушуна алып келет, ошондуктан эффективдүү аныкталып, шилтеме ырааттуулугу менен камтыла турган РНК фрагменттеринин саны азаят.РНКнын бүтүндүгүн 1% агароз гелинде жалпы РНКнын электрофорези аркылуу текшерүүгө болот.Бул ыкма гелди өзүңүз конфигурациялай алат же бүтүндүгүн текшерүү үчүн даярдалган E-Gel™ системасын колдоно алат.Жалпы РНКнын 80%тен ашыгын рибосомалык РНК түзөт, анын көпчүлүгү 28S жана 18S рРНКдан (сүт эмүүчүлөрдүн системаларында) турат.Жакшы сапаттагы РНК эки ачык жаркыраган тилкелерди көрсөтөт, алар 28S жана 18S жаркыраган тилкелер, тиешелүүлүгүнө жараша, 5 Кб жана 2 Кб жана катышы 2:1ге жакын болот.Эгерде ал диффузиялык абалда болсо, бул РНК үлгүсү бузулган болушу мүмкүн дегенди билдирет жана РНКнын сапатын андан ары текшерүү үчүн кийинчерээк сүрөттөлгөн ыкманы колдонуу сунушталат.

Сүрөт 2. Агароз гел электрофорезинде бузулган (2-сызык) жана бузулбаган РНКны (3-сызык) салыштыруу

03 Agilent Bioanalyzer

РНКнын бүтүндүгүн жөнөкөй жана тез аныктоого жардам бере турган, жогоруда сүрөттөлгөн агароз гелинин электрофорез ыкмасынан тышкары, РНКнын бүтүндүгүн аныктоо үчүн Agilent биоанализерин да колдоно алабыз.Ал РНКнын концентрациясын жана бүтүндүгүн баалоо үчүн микрофлюидиктердин, капиллярдык электрофорездин жана флуоресценциянын айкалышын колдонот.РНК үлгүсүнүн профилин талдоо үчүн орнотулган алгоритмди колдонуу менен, Agilent биоанализатору РНКнын бүтүндүгүнүн маалымдама маанисин, РНКнын бүтүндүгүнүн санын (мындан ары RIN деп аталат) эсептей алат [1].РИНдин мааниси канчалык чоң болсо, РНКнын бүтүндүгү ошончолук жогору болот (1 өтө бузулган, 10 эң толук).РНКны камтыган кээ бир эксперименттер сапатты баалоо үчүн параметр катары RINди колдонууну сунуштайт.Мисал катары жогорку өндүрүмдүүлүктөгү секвенирлөө эксперименттерин (мындан ары - NGS) алып, Thermo Fisher's Oncomine панелинин сериясындагы В клеткасынын жана Т-клеткасынын антиген рецепторлорун аныктоо үчүн колдонулган Oncomine™ Адамдын иммундук репертуарынын көрсөтмөлөрү RIN маанилери 4, Клондон жогору болгон үлгүлөрдү окууга болорун сунуштайт.Ар кандай панелдер үчүн ар кандай сунуш кылынган диапазондор бар жана көбүнчө жогорку RIN эффективдүү маалыматтарды алып келиши мүмкүн.

3-сүрөт, Oncomine™ Human Immune Repertuire эксперименттеринде, RIN 4төн жогору болгон үлгүлөр натыйжалуураак окууларды жана Т-клетка клондорун аныктай алат.【2】

Бирок, RIN мааниси да кээ бир чектөөлөр бар.RIN NGS эксперименталдык маалыматтарынын сапаты менен жогорку корреляцияга ээ болсо да, ал FFPE үлгүлөрү үчүн ылайыктуу эмес.FFPE үлгүлөрү узак убакыт бою химиялык жактан иштетилген жана алынган РНК жалпысынан салыштырмалуу төмөн RIN маанисине ээ.Бирок, бул эксперименттин натыйжалуу маалыматтары канааттандырарлык эмес болушу керек дегенди билдирбейт.FFPE үлгүлөрүнүн сапатын так баалоо үчүн биз RINден башка өлчөөлөрдү колдонушубуз керек.RINден тышкары, Agilent биоанализатору РНКнын сапатын баалоо параметри катары DV200 маанисин да эсептей алат.DV200 РНК үлгүсүндөгү 200 bp чоңураак фрагменттердин үлүшүн эсептеген параметр.DV200 RINге караганда FFPE үлгүсүнүн сапатынын жакшы көрсөткүчү.FFPE тарабынан алынган РНК үчүн ал эффективдүү аныктала турган гендердин саны жана гендердин ар түрдүүлүгү менен өтө жогорку корреляцияга ээ [3].DV200 FFPE сапатын аныктоодогу кемчиликтердин ордун толтурса да, Agilent биоанализатору дагы эле РНК үлгүлөрүндөгү сапат көйгөйлөрүн, анын ичинде үлгүлөрдөгү ингибиторлор бар-жогун ар тараптуу талдай албайт.Ингибиторлор өздөрү ылдый агымдагы эксперименттердин күчөтүү эффективдүүлүгүнө таасирин тийгизип, пайдалуу маалыматтардын көлөмүн азайтышы мүмкүн.Үлгүдө ингибитор бар же жок экенин билүү үчүн, биз реалдуу убакытта флуоресценттик сандык ПТР ыкмасын колдоно алабыз.

04 реалдуу убакыт флуоресценттик сандык ПТР

Реалдуу убакыттагы флуоресценттик сандык ПТР ыкмасы үлгүдөгү ингибиторлорду гана аныктабастан, FFPE үлгүсүндөгү РНКнын сапатын да так чагылдыра алат.Agilent биологиялык анализаторлору менен салыштырганда, реалдуу убакыттагы флуоресценттик сандык аспаптар кеңири колдонулушуна байланыштуу негизги биологиялык лабораторияларда популярдуу.РНК үлгүлөрүнүн сапатын текшерүү үчүн, GUSB (Cat № Hs00939627) сыяктуу ички маалымдама гендер үчүн праймердик зонддорду гана сатып алуу же даярдоо керек.Абсолюттук сандык эксперименттерди жүргүзүү үчүн праймерлердин, зонддордун жана стандарттардын бул топтомун (белгилүү концентрациядагы жалпы РНК) колдонуу менен, РНКнын фрагментинин эффективдүү концентрациясын РНКнын сапатын баалоо стандарты катары эсептесе болот (кыскача Функционалдык РНКнын санын аныктоо (FRQ)).NGS тестинде биз РНК үлгүлөрүнүн FRQ эффективдүү маалымат көлөмү менен абдан жогорку корреляцияга ээ экенин таптык.0.2ng/uL FRQ жогору баардык үлгүлөр үчүн окуулардын кеминде 70% шилтеме ырааттуулугун эффективдүү камтышы мүмкүн (4-сүрөт).

4-сүрөт, флуоресценттик сандык ыкма менен аныкталган FRQ мааниси NGS экспериментинде алынган эффективдүү маалыматтар менен өтө жогорку корреляцияга ээ (R2>0,9).Кызыл сызык 0,2 нг/уЛ (log10 = -0,7) барабар FRQ мааниси болуп саналат.【4】

FFPE үлгүлөрүнүн колдонулушунан тышкары, реалдуу убакыттагы сандык ПТР ыкмасы үлгүлөрдөгү ингибиторлорду да натыйжалуу көзөмөлдөй алат.Биз аныктала турган үлгүнү Ички Позитивдик Башкаруу (IPC) жана анын анализи менен реакция системасына кошуп, андан кийин Ct маанисин алуу үчүн флуоресценттик квантификацияны жүргүзө алабыз.Эгерде Ct мааниси үлгүсүз реакцияда Ct маанисинен артта калса, анда ингибитор үлгүдө бар экенин көрсөтүп турат жана реакцияда күчөтүү эффективдүүлүгүнө бөгөт коёт.

05 Qubit флуоресценттик боёк ыкмасы

Qubit Fluorometer нуклеин кислотасынын концентрациясын жана тазалыгын аныктоо үчүн эң көп колдонулган кичинекей аппарат, аны иштетүү оңой жана дээрлик ар бир молекулярдык биология лабораториясында бар.Ал нуклеин кислотасынын концентрациясын аныктоо жана нуклеин кислотасын байланыштыруучу флуоресценттик боёк (Qubit аныктоо реагенти) аркылуу так эсептейт.Кубит жогорку сезгичтикке жана өзгөчөлүккө ээ жана РНКны pg/µL концентрациясына чейин так сандай алат.Нуклеиндик кислотанын концентрациясын так сандык эсептөө жөндөмдүүлүгүнөн тышкары, Термо Фишердин акыркы жаңы модели Qubit 4.0 да РНКнын бүтүндүгүн аныктай алат.Qubit 4.0 РНК аныктоо системасы (RNA IQ Assay) бир эле учурда эки өзгөчө флуоресценттик боёкторду аныктоо аркылуу РНКнын бүтүндүгүн аныктайт.Бул эки флуоресценттик боёк РНКнын чоң фрагменттерине жана кичине фрагменттерине байланыша алат.Бул эки флуоресценттик боектор үлгүдөгү РНКнын чоң фрагменттеринин үлүшүн көрсөтүп турат жана ушундан РНКнын сапатын билдирген IQ (Бүтүндүк жана Сапат) маанисин эсептеп чыгууга болот.IQ мааниси FFPE жана FFPE эмес үлгүлөргө да тиешелүү жана кийинки секвенирлөө сапатына чоң таасирин тийгизет.Мисал катары NGS эксперименттерин алсак, Ion torrent™ платформасында жүргүзүлгөн RNA-Seq сыноо эксперименттеринде, IQ мааниси 4төн жогору болгон үлгүлөрдүн көбү кеминде 50% эффективдүү окууга ээ болгон (5-сүрөт).Жогоруда айтылган аныктоо ыкмалары менен салыштырганда, Qubit IQ Assay иштөөгө ыңгайлуураак жана азыраак убакытты талап кылбастан (беш мүнөттүн ичинде), ошондой эле өлчөнгөн IQ параметри менен ылдый агымдагы эксперименттердин маалымат сапаты ортосунда чоң корреляцияга ээ.

5-сүрөт, Qubit RNA IQ мааниси менен RNA-Seq карталанган окууларынын ортосунда чоң корреляция бар.【5】

Жогорудагы кириш сөз аркылуу мен ар бир адам РНКнын сапатын көзөмөлдөөнүн ар кандай ыкмаларын жетиштүү түшүнөт деп эсептейм.Иш жүзүндө, сиз тандай аласызүлгү түрүнө жана колдонуудагы аспаптарга ылайык тиешелүү ыкма.РНКнын сапатын жакшылап көзөмөлдөө менен гана биз үлгүнүн сапаты начар болгон кийинки эксперименттердин ийгиликсиз болушунан кача алабыз, ошону менен баалуу убакытты, энергияны жана чыгымды үнөмдөй алабыз.

Шилтеме продуктылар:

Жаныбарлардын жалпы РНК изоляциясынын комплекти

Клетканын жалпы РНК изоляциясынын комплекти

шилтемелер

【1】Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. et al.RIN: РНК өлчөөлөрүнө бүтүндүктүн маанилерин ыйгаруу үчүн РНКнын бүтүндүгү номери.BMC Molecular Biol 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】Oncomine адамдын иммундук репертуарынын колдонуучу колдонмосу (Бас. № MAN0017438 Rev. C.0).

【3】Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Archival Formalin-Fixed Paffin-Embedded Tissue Samples from Assessing RNA's Assessing Quality Metrics for Archival Formalin-Fixed Paffin-Embedded Tissue Samples, Toxicological Sciences, 170-б. 7–373,https://doi.org/10.1093/toxsci/