Биз тажрыйбалуу өндүрүүчү болдук.Чоң арзандатуу Кытай жогорку сезгичтүү бир кадамдык зонд Rt үчүн өзүнүн рыногунун маанилүү сертификаттарында көпчүлүктү жеңип алды.QpcrKit V2, Сапат - бул фабриканын жашоосу, Кардардын суроо-талабына көңүл буруу - бул компаниянын аман калышынын жана өнүгүүсүнүн булагы, Биз чынчылдыкты жана ак ниеттүү иштөө мамилесин карманабыз, сиздин келишиңизди чыдамсыздык менен күтөбүз!
Биз тажрыйбалуу өндүрүүчү болдук.Анын рыногунун маанилүү сертификаттарында көпчүлүктү утуп алууКытай Так ДНК Полимераза, Qpcr, Биздин компания убада кылат: акылга сыярлык баалар, кыска өндүрүш убактысы жана канааттандырарлык кийин сатуу кызматы, биз да каалаган убакта биздин фабрика иш сапары менен тосуп алуу.Эми биз бирге жагымдуу жана узак мөөнөттүү бизнести каалайбыз!!!

Сүрөттөмөлөр

Бул комплект уникалдуу лизис буфердик тутумун колдонот, ал РНКны RT-qPCR реакциялары үчүн культураланган клетка үлгүлөрүнөн тез чыгара алат, ошону менен көп убакытты талап кылган жана РНКны тазалоо процессин жокко чыгарат.РНК үлгүсүн 7 мүнөттө эле алууга болот.Комплект тарабынан берилген 5×Direct RT Mix жана 2×Direct qPCR Mix-SYBR реагенттери реалдуу убакытта сандык ПТР натыйжаларын тез жана эффективдүү ала алышат.

5×Direct RT Mix жана 2×Direct qPCR Mix-SYBR күчтүү ингибиторлорго толеранттуулукка ээ жана үлгүлөрдүн лизаты түздөн-түз RT-qPCR үчүн шаблон катары колдонулушу мүмкүн.Бул комплект уникалдуу РНКнын жогорку жакындыктагы Foregene тескери транскриптазасын жана Hot D-Taq ДНК полимеразасын, dNTPs, MgCl камтыйт.₂, реакция буфери, ПЦР оптимизатору жана стабилизатор.

Техникалык шарттар

200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns

Комплекттин компоненттери

Өзгөчөлүктөрү жана артыкчылыктары

■ Жөнөкөй жана эффективдүү: Cell Direct RT технологиясы менен РНК үлгүлөрүн 7 мүнөттүн ичинде алууга болот.

■ Үлгү суроо-талап аз, 10 клетканы сынаса болот.

■ Жогорку өткөрүү жөндөмдүүлүгү: ал 384, 96, 24, 12, 6 көзөнөктүү плиталарда өстүрүлгөн клеткаларда РНКны тез аныктай алат.

■ ДНК өчүргүч бошотулган геномдорду тез эле жок кыла алат, андан кийинки эксперименттик натыйжаларга таасирин бир топ азайтат.

■ Оптималдаштырылган RT жана qPCR системасы эки баскычтуу RT-PCR тескери транскрипциясын натыйжалуураак жана ПТРди спецификалык жана RT-qPCR реакциясынын ингибиторлоруна туруктуураак кылат.

Kit колдонмосу

Колдонуу чөйрөсү: маданияттуу клеткалар.

- Үлгү лизиси аркылуу чыгарылган РНК: бул комплекттин RT-qPCR үлгүсүнө гана тиешелүү.

- Комплект төмөнкү максаттарда колдонулушу мүмкүн: ген экспрессиясын талдоо, siRNA аркылуу генди өчүрүү эффектин текшерүү, дары скрининги ж.б.

Диаграмма

Сактоо жана сактоо мөөнөтү

Бул комплекттин I бөлүгү 4℃ температурада сакталышы керек;II бөлүгү -20 ℃ сакталышы керек.

Foregene Protease Plus II 4℃ температурада сакталышы керек, -20 ℃ тоңдурбаңыз.

Реагент 2×Direct qPCR Mix-SYBR -20℃ караңгыда сакталышы керек;тез-тез колдонулса, ал ошондой эле кыска мөөнөттүү сактоо үчүн 4℃ сакталышы мүмкүн (10 күндүн ичинде колдонуу). Биз тажрыйбалуу өндүрүүчү болдук.Чоң арзандатуу Кытай жогорку сезгичтүү бир кадамдык зонд Rt-Qpcr комплект V2 үчүн өзүнүн рыногунун маанилүү сертификаттарында көпчүлүктү утуп алуу, Сапат - бул фабриканын жашоосу, Кардардын суроо-талабына көңүл буруу - компаниянын аман калышынын жана өнүгүүсүнүн булагы, Биз чынчылдыкты жана ак ниеттүү иштөө мамилесин карманабыз, сиздин келээриңизди чыдамсыздык менен күтөбүз!
Чоң арзандатууКытай Так ДНК Полимераза, Qpcr, Биздин компания убада кылат: акылга сыярлык баалар, кыска өндүрүш убактысы жана канааттандырарлык сатуудан кийинки тейлөө, биз да каалаган убакта биздин фабрика иш сапары менен тосуп алуу.Эми биз бирге жагымдуу жана узак мөөнөттүү бизнести каалайбыз!!!

QuickEasyTM Cell Direct RT-qПЦР Kit -Taqman

Cat.No.DRT-01021/01022

≤ 1000 000 клетканы колдонуу менен түз RT-qPCR үчүн

Продукт менен тааныштыруу

Бул продукт уникалдуу лизис буфердик тутумун колдонот, бул RT-qPCR реакциялары үчүн маданияттуу клетка үлгүлөрүнөн РНКны тез чыгаруу үчүн, көп убакытты талап кылган жана эмгекти талап кылган РНКны тазалоо процессин жокко чыгарат жана 5× Түз RT Mix, 2× Түз qPCR Mix-Taqman менен талап кылынган РНК үлгүсүн алуу үчүн болгону 7 мүнөт гана убакытты талап кылат.

5× Түздөн-түз RT Микс жана 2× Түз qPCR Mix-Taqman күчтүү ингибиторго толеранттуулукка ээ жана үлгү катары өлчөнө турган үлгүдөгү лизаттын жардамы менен эффективдүү тескери жана конкреттүү күчөтүүнү аткара алат.Реагенттин курамында Foregene Reverse Transscriptase, Hot D-Taq ДНК Полимераза, dNTPs, MgCl бар.₂, Реакция буфери, ПТР оптимизатору жана стабилизатор, лизис буфери менен үлгүлөрдү тез жана оңой аныктоо үчүн колдонулушу мүмкүн жана жогорку сезгичтик, өзгөчөлүк жана туруктуулук мүнөздөмөлөрүнө ээ.

Продукт өзгөчөлүктөрү

Жөнөкөй, эффективдүү Cell Direct RT технологиясы РНК үлгүлөрүн алуу үчүн 7 мүнөттөй аз убакытты талап кылат.

Үлгүгө талаптар аз жана эксперимент үчүн кеминде 10 культураланган клетка колдонулушу мүмкүн.

384, 96, 24, 12 жана 6-кудук плиталар сыяктуу маданияттуу клеткалардын РНКны тез алуу үчүн жогорку өткөрүү жөндөмдүүлүгү.

ДНК өчүргүч бошотулган геномдорду тез алып салууга жөндөмдүү жана кийинки эксперименттик натыйжаларга тийгизген таасирин бир топ азайтат.

Оптимизацияланган RT жана qPCR системалары эффективдүү тескери транскрипциясы, өзгөчөлүгү жана күчтүү RT-qPCR реакциясынын ингибиторунун толеранттуулугу менен эки баскычтуу RT-PCRди иштетет.

Kit колдонмосу

Колдонуу чөйрөсү: Маданияттуу клеткалар.

Үлгү лизиси РНКны чечмелейт: эки баскычтуу RT-qPCR шаблону катары гана колдонулат.

Комплекттер төмөнкү максаттарда колдонулушу мүмкүн: гендердин регулятивдик экспрессиясын талдоо, аллелдерди текшерүү, дары-дармектерди скрининг ж.б.

Комплекттин чектөөлөрү

Күчөтүлгөн фрагменттер ≤ 300 bp.

Комплекттер клеткаларды жаңыдан өстүрүү үчүн колдонулат.

Продукциянын сапатын контролдоо

FOREGENEнин Сапатты башкаруунун жалпы тутумуна ылайык, Cell Direct RT-qPCR серияларынын ар бир партиясы комплекттердин ар бир партиясынын сапатынын ишенимдүүлүгүн жана туруктуулугун камсыз кылуу үчүн бир нече жолу катуу сыналган.

Комплекттин мазмуну

*:Cell Lysis, 5×Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman өзүнчө сатып алса болот, чоо-жайы 1-тиркемеде келтирилген (13-БЕТ).

Сактоо шарттары

1. Жеткирүү шарттары

Комплекттин <4 °C абалында болушун камсыз кылуу үчүн төмөнкү температурадагы муз пакетинин кутучасын ташуу процесси.

2. Сактоо шарттары

I бөлүгүн 4°C, II бөлүгүн -20°С температурада сактаңыз.

Foregene Protease Plus II -20°C тоңдурулган эмес, 4°C температурада сакталышы керек.

Реагент 2× Түз qPCR Mix-Taqman -20°C, же тез-тез колдонулса (10 күндүн ичинде) кыска мөөнөттүү колдонуу үчүн 4°C температурада сакталат.

Комплекттин компоненти жөнүндө маалымат

Буфер CL: Клетка лизис реакциялары үчүн зарыл болгон чөйрөнү камсыз кылат.

Буфер ST: кийинки RT таасирлерин болтурбоо үчүн лизаттагы активдүү затты токтотот.

ДНК өчүргүч: ДНКны жок кылуучу, кийинки эксперименттерде геномду жок кылуунун таасири.

5× Түздөн-түз RT Микс: Оптималдуу тегиздөө үчүн жогорку РНК жакындыгы бар Foregene Reverse Transscriptase, RNase Inhibitor, dNTPs, стабилизаторлор, күчөткүчтөр, оптимизаторлор жана тескери транскрипция праймерлери (Random Primer, Oligo(dT))₁₈Primer).

Foregene Protease Plus II: Лизис буферинин контекстинде клеткалар нуклеиндик кислоталарды чыгаруу үчүн лизденет.

2× Түз qPCR Mix-Taqman: Бул реагент ысык D-Taq ДНК Полимеразаны, dNTPs, MgCl камтыйт₂, реакция буфери, ПТР оптимизатору жана стабилизатор.

20× ROX маалымдама боёгу: Негизинен ABI, Stratagene жана башка компаниялардын реалдуу убакытта ПТР күчөтүү аспаптарында колдонулат, ал ПТР түтүктөрүнүн жана ПТР дозалоо каталарынан келип чыккан түтүктөрдүн ортосундагы айырманы тууралоо үчүн колдонулат.Ар кандай аспаптар үчүн талап кылынган 20× ROX Reference Dye концентрациясы ар түрдүү жана колдонуучу аны аспаптын сунушталган концентрациясына ылайык кошо алат.

RNase-Free ddH₂O: эки баскычтуу RT-qPCR реакциялары үчүн RNase-эркин стерилденген ультра таза суу.

Cактык чаралары:(Комплектти колдонуудан мурун сактык чараларын кылдат окуп чыгыңыз)

Үлгүлөрдүн ортосунда кайчылаш булганууну болтурбоо үчүн эксперименттин иштөө ыкмасына көңүл буруңуз.

RNase булганышын жана РНК деградациясын болтурбоо үчүн эксперименталдык чөйрөнүн жана идиштердин тазалыгына көңүл буруңуз.

Жаңы же жакшы сакталган клетка үлгүлөрүн алыңыз жана эч качан кайталанган тоңдурулган клетка үлгүлөрүн колдонбоңуз.

5× Түз qPCR Микс, 2× Түз qPCR Микс-Такман кайра-кайра тоңдуруудан качышы керек, антпесе ал тескери транскрипцияга жана ПТР эффективдүүлүгүнө таасирин тийгизет.

Даярдоорациондормуруноперация

Бул комплектти колдонуудан мурун нускаманы кунт коюп окуп чыгыңыз.Cell Direct RT-qPCR комплекти жөнөкөй, ыңгайлуу жана иштөө үчүн тез жана нускамалар бардык комплект жана аны кантип туура колдонуу керектиги жөнүндө толук маалымат берет.Колдонуудан мурун керектүү эксперименталдык материалдарды жана жабдууларды даярдаңыз.

Эксперименталдык материалдар жана жабдуулар

◆ Маданият клеткалары.

◆ 1,5 мл же 2 мл, RNase-/DNase-Free центрифуга түтүгү, RNase-/DNase-Free учу, 0,2 мл стерилдүү qPCR түтүгү.

◆ qPCR машинасы, пипетка, стол үстүндөгү центрифуга (≥13,400×ж) (эксперименттик керектөөлөргө жараша) ж.б.

Коопсуздук

◆ Бул продукт илимий изилдөө максаттары үчүн гана, сураныч, аны фармацевтикалык, клиникалык, тамак-аш жана косметикалык максаттарда колдонбоңуз.

◆ Химиялык заттарды колдонууда лабораториялык кийимдерди, кол каптарды, коргоочу көз айнектерди ж.б. кийиңиз.

Операциягиддер

Клетка лизиси системалары, RT системалары жана qPCR реакция эритмесинин кошумча пакеттерин 1-тиркемеде (13-БЕТ) чоо-жайын билүү үчүн өзүнчө сатып алса болот.

Операция боюнча колдонмо

A: үлгү РНК чыгаруу

1.Клеткалар алдын ала даярдалган: Клетка маданиятынын пластинкасын муздак PBS менен жууп, андан кийин клеткаларды лизис (10-10)⁶), 10⁶ РНКны экстракциялоо жана тазалоо үчүн Клетканы бир РНК изоляциялоо комплекти (DE-03111) же жаныбарлардын жалпы РНК изоляциялык комплекти (DE-03011) сунушталат.

1.1.Жабышкан клеткалар (мисалы катары 24 көзөнөктүү плита)

1.1.1.Ар бир кудуктагы клеткалардын санын аныктагыла, клеткалардын саны 1 × 10 экенин аныктагыла⁵, жана маданий идиштен маданият чөйрөсүн алып салуу үчүн пипетка колдонуңуз.

1.1.2.Ар бир кудукка 200 мкл алдын ала муздатылган 1 × PBS кошуңуз.Кайталап пипет кылбаңыз жана скважиналардан PBS алып салбаңыз.Пластинканы эңкейтип, мүмкүн болушунча көп PBS алып салыңыз.2-кадамга өтүңүз.

1.1.3.Ар кандай клетка маданияты табак же бир клетка маданият табак 1-1 маалымдама номери стол клетка жуу үчүн 1 × PBS алдын ала муздатылган кошулган.

Таблица 1-1: ар кандай клеткалар үчүн PBS дозасы

Эскертүү:бекем жабышкан клеткаларды камсыз кылуу үчүн,жууп жатканда клеткалардын көп жоголушуна жол бербейт.

1.2.Асма клеткалар же жабышчаак клеткалар тешиктүү эмес пластиналарда өстүрүлгөн

1.2.1.Көп скважиналуу эмес пластинкаларда өстүрүлгөн адгеренттүү клеткалар (суспензия клеткалары кийинки кадам 1.2.2-ден башталат), клеткаларды кадимки клетка чогултуу ыкмасына ылайык чогултуп, бөлүп, культуралык пластинкага же центрифугалык түтүккө жайгаштырышат;эгерде трипсинация колдонулса, клеткаларды чогултуу жана калдык трипсинди алып салуу үчүн центрифугалоо талап кылынат, PBS кайра суспензияланган клеткалар клеткаларды таратуу үчүн жеке клеткаларга кошулду.

1.2.2.Клеткалардын саны саналгандан кийин, 1×10 уячалар бөлүнөт⁵ бири түтүктөрдү центрифугалоо үчүн, клеткаларды 1000 × г центрифугалоо жолу менен 10 мүнөткө чогултуу.

1.2.3.Центрифуга түтүкчөсүнө 200 мкл PBS кошуңуз, кайра-кайра пипет кылбаңыз жана PBSти түз соруп алыңыз.2-кадамга өтүңүз. (Эгерде чөктүрүү кыйын болсо жана клеткалар кайра суспензияланса, 1000 × г центрифугада 10 мүнөттөн кийин супернатантты таштагандан кийин, клетка таблеткалары 2-кадамга өтүшөт)

2.Cell лизиси: Булфер CLди алып салыңыз, анын температурасы бөлмө температурасында, ДНК Eraser жана Foregene Protease Plus II, төмөнкү таблицага ылайык, 1-2 даярдалган лизис системасына шайкеш келет: (Лизис эритмеси колдонууга даяр).

Таблица 1-2: бөлүү системаны даярдоо (Эскертүү: муз үстүндөгү даярдоодо)

3.(Мисал катары 24-кудук табак) Ар бир кудукка 200 мкл клетка лизис мастер аралашмасын пипетка менен куюп, 5-10 жолу кайталап үйлөп, бөлмө температурасында (20-25 ℃) 5 мүнөт инкубациялаңыз.

Эскертүү:Көпүрөктөрдүн пайда болушуна жол бербөө үчүн, пипеткалоодо пипетка шкаласын 200 мкл же андан азыраак кылып тууралаңыз.Лизистен кийин клеткалар булуттуу көрүнүшү мүмкүн, бул нормалдуу.

4.(Мисалы катары 24-кудук табак) суюктукка 20 мкл Buffer ST кошулду (ар кандай лизис системалары Buffer ST 1-3-таблицада көрсөтүлгөн өлчөмдө кошулду), 5-10 жолу кайталанган пиптинг, бөлмө температурасында (20-25 ℃) 2 мүнөт инкубацияланды.

Эскертүү:Пипетка учу лизат кошулганын камсыз кылуу үчүн беттин астына жайгаштырылды,көбүкчөлөрдүн пайда болушуна жол бербөө үчүн, пипеткалоодо пипетка шкаласын 200 мкл же андан азыраак кылып тууралаңыз.

Таблица 1-3:Buffer ST кошуу

5.The lysate кийинки RT-qPCR эксперименттер үчүн колдонулат.Эгерде кийинки эксперименттерди өз убагында жүргүзүү мүмкүн болбосо, музда 2 сааттан ашык эмес кармаңыз жана -20℃ же -80 ℃ (үч айдан ашык эмес) температурада сактаңыз.

B: RT системасын даярдоо

1.5 × Түздөн-түз RT Mix алып чыгып, муз ваннага коюп, табигый эрип, кийинчерээк колдонуу үчүн акырын аралаштырыңыз;RNase-Free ddH2O алып, аны эритип, кийинчерээк колдонуу үчүн муз ваннасына коюңуз.Төмөндөгү 2-1-таблицага ылайык муз үстүндөгү реакциялык системаны даярдаңыз.

Таблица 2-1: RT реакция системасын даярдоо

2. Системаны түзүү аяктагандан кийин, акырын аралаштырылган жана төмөнкү таблицада кыскача центрифугаланган 2 -2 реакция шарттары RT реакциясы.

Таблица 2-2: RT Реакция шартын орнотуу

3. Реакция аяктагандан кийин, реакция продуктусу qPCR үчүн түздөн-түз музга коюлду, сураныч, узак мөөнөттүү сактоо -20 ℃ же -80 ℃ койуңуз.

Эскертүү: Тазаланбаган шаблонду колдонуудан улам тескери транскрипция продуктусунда ак чөкмөлөр пайда болушу мүмкүн.Бул кадыресе көрүнүш.Кийинки эксперименттер үчүн үстүнкү затты дароо центрифугалаңыз.

Алынган RT реакция эритмеси кийинки Step Real Time ПТР реакция системаларына кошулат, реакция системасынын 10-30% чейинки өлчөмдөрүн кошуу сунушталат.

C: qPCR реакция системасын даярдоо

1. Реакция системасын даярдоо үчүн төмөнкү 3-1-таблицага ылайык кадам cDNA үлгүсүндө даярдалган B тиешелүү өлчөмдө.

Эскертүү: cDNA шаблонунун көлөмү qPCR системасынын 10-30% түзөт.Мисалы, 20μl qPCR системасында 2-6 мкл лизис буферин кошуңуз, бирок 6 мклден ашпаңыз.

2. qPCR реакциясы үчүн оптималдаштыруу жакшы qPCR шарттары (Annealing температурасы, ж.б.) (реакция шарттары 3-2-таблицада берилген).

Эскертүү: Жакшыраак натыйжаларды алуу үчүн qPCR реакциялары үчүн оптималдаштырылган шарттарды колдонууга аракет кылыңыз.

Таблица 3-1: ПЦР реакция системасын даярдоо

1*: Праймердин концентрациясын 50-900 нМ диапазондо жөндөөгө болот, эгерде праймер реакциясы начар болсо.

Эскертүү: qPCR системасы эксперименталдык муктаждыктарга жана флуоресценттик циклдердин моделине ылайык жөндөлүшү мүмкүн.qPCR үчүн 50μl системасы, реагенттин дозасын 20га ылайык пропорционалдуу тууралаңызμл системасы.

2*: Флуоресценттик сандык термикалык циклге ылайык ROX Reference Dye тиешелүү акыркы концентрациясын тандаңыз.Кадимки флуоресценттик сандык циклерлер үчүн эң ылайыктуу ROX Reference Dye концентрациялары төмөнкү таблицада көрсөтүлгөн:

Таблица 3-2: qPCR реакция шарттары берилген

Эскертүү: Эң жакшы qPCR эффектин алуу үчүн, градиенттик ПТР ар кандай калыптар жана ар кандай праймерлер үчүн реакция шарттарын оптималдаштыруу үчүн колдонулушу мүмкүн.ПЦР реакциясынын шарттары флуоресценттик анализаторго, шаблонго, праймерге, ж.б. жараша өзгөрүп турат. Конкреттүү операцияда оптималдуу реакция шарттары флуоресценттик сандык термикалык циклдердин конкреттүү шарттарына, шаблондун тибине, кызыктырган фрагменттин өлчөмүнө, күчөтүлгөн фрагменттин базалык ырааттуулугуна жана GC мазмунуна жана температуралык праймерлердин узактыгына, анын ичинде реакциянын убактысына жана ж.б. жараша долбоорлонушу керек.

Real Time ПТР праймерди долбоорлоо принциптери

Алдыга Primer жана Reverse Primer

Real Time ПТР үчүн праймердин дизайны абдан маанилүү.Праймерлер ПТР күчөтүүнүн өзгөчөлүгүнө жана эффективдүүлүгүнө байланыштуу жана төмөнкү принциптерге таянуу менен иштелип чыгышы мүмкүн:

◆ Primer узундугу: 18-30bp.

◆ GC мазмуну: 40-60%.

◆ Tm мааниси: Primer дизайн программасы, мисалы, Primer 5, праймердин Tm маанисин бере алат.Жогорку жана төмөнкү агымдык праймерлердин Tm маанилери мүмкүн болушунча жакын болушу керек.Tm эсептөө формуласын да колдонсо болот: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).ПТР жүргүзүүдө, жалпысынан 5 °C праймердин Tm маанисинен төмөн температура күйдүрүү температурасы катары тандалат (тамырлоо температурасынын тиешелүү жогорулашы ПТР реакциясынын өзгөчөлүгүн жогорулатат).

◆ Праймерлер жана ПТР продуктулары:

◆ Дизайн праймер ПТР күчөтүү продукт узундугу артык 100-150bp болуп саналат.

◆ Калыптын экинчилик структуралык аймагындагы дизайн праймерлеринен мүмкүн болушунча качуу керек.

◆ Агымдагы жана ылдыйкы праймерлердин 3′ учтарынын ортосунда 2 же андан көп кошумча негиздер пайда болбошу керек.

◆ Primer 3′ терминалдык базасы 3 кошумча катары менен G же C болушу мүмкүн эмес.

◆ Праймерлердин өзүндө кошумча структуралар болушу мүмкүн эмес, антпесе ПЦР күчөшүнө таасир этүүчү чачтын түзүлүшү пайда болот.

◆ ATCG праймер ырааттуулугунда мүмкүн болушунча бирдей бөлүштүрүлүшү керек, жана 3′ терминалдык база Т катары качуу керек.

Тиркеме1:Cell DirectRT-qPCR Компонент комплектt кошумча пакети

1.Cell Lysis Solution