1. Алгачкы түшүнүү

Бул этапта биз улууларыбыздын алдында ката кетирбөө үчүн кээ бир түшүнүктөрдү жана терминологияларды түшүнүшүбүз керек, мисалы:

С: RT-PCR, qPCR, реалдуу убакыттагы ПТР жана реалдуу убакыттагы RT-PCRдин ортосунда кандай айырма бар?

Жооп: RT-PCR – бул тескери транскрипциялуу ПТРПолимераздык чынжыр реакциясынын (ПЦР) кеңири колдонулган варианты (кайтарым транскрипциялуу ПТР, RT-PCR).RT-ПЦРде РНК тилкеси тескери түрдө толуктоочу ДНКга транскрипцияланат, ал андан кийин ПТР аркылуу ДНКны күчөтүү үчүн шаблон катары колдонулат.
Реалдуу убакыттагы ПТР жана qPCR(Cantitative Rea-ltime-PCR) бир эле нерсе, экөө тең реалдуу убакыт режиминдеги сандык ПТР, бул ПТРдин ар бир циклинде реалдуу убакыт режиминде маалымат жазуулары бар, ошондуктан баштапкы калыптардын санын так талдоо тууралоого болот.

Реалдуу убакыттагы ПТР (реалдуу убакыттагы флуоресценттик сандык ПТР) жана тескери транскрипциялуу ПТР (тескери транскрипциялуу ПТР) RT-PCR катары кыскартылгандай көрүнгөнү менен, эл аралык конвенция: RT-PCR өзгөчө тескери транскрипцияга тиешелүү.ПТР , Реалдуу убакыттагы ПТР жалпысынан qPCR (сандык реалдуу убакыт ПТР) катары кыскартылган..

Ал эми реалдуу убакыт режиминдеги RT-PCR (RT-qPCR), бул флуоресценттик сандык технология менен айкалышкан тескери транскрипциялуу ПТР.: адегенде РНКнын тескери транскрипциясынан cDNA (RT) алыңыз, андан кийин сандык анализ (qPCR) үчүн Реалдуу убакыттагы ПТРди колдонуңуз.Көпчүлүк лабораториялар RT-qPCR, башкача айтканда, РНК экспрессиясынын төмөндөшүн жөнгө салуу боюнча изилдөө жүргүзүшөт, андыктан лабораторияда бардыгы айтып жаткан qPCR чындыгында RT-qPCRге тиешелүү, бирок клиникалык колдонмолордо дагы эле көп ДНК тесттери бар экенин унутпаңыз.Сандык талдоо, мисалы, гепатит В вирусу HBV аныктоо.

Суроо: Көптөгөн флуоресценттик сандык ПТРди окугандан кийин, эмне үчүн күчөтүлгөн фрагментти 80-300bp чегинде көзөмөлдөө керек?

Жооп: Ар бир ген ырааттуулугунун узундугу ар кандай, кээ бирлери бир нече кб, кээ бирлери жүздөгөн bp, бирок праймерлерди долбоорлоодо продуктунун узундугун 80-300bp гана талап кылышыбыз керек, өтө кыска же өтө узун флуоресценттик сандык ПТР аныктоого ылайыктуу эмес.Продукттун фрагменти праймер-димерден айырмалоо үчүн өтө кыска.Primer-dimer узундугу болжол менен 30-40bp болуп саналат жана ал 80bp аз болсо, ал праймер-димер же продукт экенин айырмалоо кыйын.продукт фрагменти өтө узун болсо, 300bp ашса, ал жонокой төмөн күчөтүү натыйжалуулугун алып келет жана натыйжалуу ген көлөмүн аныктоо мүмкүн эмес.

Мисалы, класста канча адам бар экенин санаганда, канча ооз бар экенин гана санаш керек.Сиз гендерди аныктаганыңызда да ушундай болот, сиз гендин белгилүү бир ырааттуулугун көрсөтүшүңүз керек, бүт ырааттуулук аткарат.Элди санагыңыз келсе, оозду да, мурунду да, кулакты да, көз айнекти да санашыңыз керек, ката кетириш оңой.

Кеңейтүү үчүн, биологиялык изилдөөлөрдө чекиттен аймакка көптөгөн изилдөө учурлары бар, анткени ар кандай түрдүн ген ырааттуулугу өтө узун болгондуктан, бардык фрагменттерди өлчөө керексиз жана мүмкүн эмес, мисалы, бактериялык 16S секвенциясы, бул бактериялардын консервативдик ырааттуулугун жүргүзүү, бактериялардын белгилүү бир популяциясынын санын чыгаруу үчүн Assays.

С: qPCR праймер дизайны үчүн оптималдуу узундук кандай?

Жооп: Жалпысынан айтканда, праймердин узундугу болжол менен 20-24bp, бул жакшыраак.Албетте, биз праймерди долбоорлоодо анын TM маанисине көңүл бурушубуз керек, анткени бул оптималдуу күйгүзүү температурасына байланыштуу.Көптөгөн эксперименттерден кийин 60°C жакшыраак ТМ мааниси экени далилденди.Эгерде күйгүзүү температурасы өтө төмөн болсо, анда ал оңой эле өзгөчө эмес күчөтүүгө алып келет.Эгерде күйгүзүү температурасы өтө жогору болсо, күчөтүү эффективдүүлүгү салыштырмалуу төмөн болот, күчөтүү ийри сызыгынын чокусу кийинчерээк башталат жана КТ мааниси кечеңдейт.

С: Боёк ыкмасы зонд ыкмасынан эмнеси менен айырмаланат?

Жооп: Боёк ыкмасыКээ бир флуоресценттик боёктор, мисалы, SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, ж.Ошондуктан, ПТР реакциясынын башында машина флуоресценттик сигналды аныктай албайт.Реакция күйгүзүү-узартуу стадиясына жеткенде, кош тизмек ачылып, ДНК-полимеразанын таасири астында жаңы тилке синтезделет жана флуоресценттик молекула dsDNA кичине оюгу менен байланышат.ПТР циклдеринин саны көбөйгөн сайын, көбүрөөк боёктор кош саптуу ДНК менен айкалышат жана флуоресценттик сигнал да тынымсыз жогорулайт.Боёк ыкмасы негизинен илимий изилдөөдө колдонулат.
PS: Эксперимент жасап жатканда этият болуңуз, боёк адамдын ДНКсы менен айкалыштырылышы керек, аны флуоресценттик адамга айлантуудан этият болуңуз.

Боёо ыкмасы (солдо) Зонд ыкмасы (оңдо)
PS: Эксперимент жасап жатканда этият болуңуз, боёк адамдын ДНКсы менен айкалыштырылышы керек, аны флуоресценттик адамга айлантуудан этият болуңуз.

SYBR Green Ⅰ ДНКнын кичине оюгу менен байланышат

Текшерүү ыкмасыТакман зонд - эң көп колдонулган гидролиздик зонд.Зонддун 5′ аягында флуоресценттик топ бар, адатта FAM, жана зонд өзү максаттуу генди толуктоочу ырааттуулук болуп саналат.3′ аягында флуоресценттик өчүрүү тобу бар.Флуоресценттик резонанстык энергияны берүү принцибине ылайык (Förster резонанстык энергиянын трансфери, FRET) кабарчы флуоресценттик топ (донордук флуоресценттик молекула) жана өчүрүүчү флуоресценттик топ (акцептордук флуоресценттик молекула) дүүлүккөндө. акцептордук молекула, ал эми автофлуоресценция алсыратат.Ошондуктан, ПТР реакциясынын башталышында, зонд системада бош жана бүтүн болгондо, репортер флуоресценттик топ флуоресценцияны чыгарбайт.Жылуулоодо праймер жана зонд шаблонго байланат.Узартуу стадиясында полимераз тынымсыз жаңы чынжырларды синтездейт.ДНК полимераза 5′-3′ экзонуклеаза активдүүлүгүнө ээ.Зондго жеткенде ДНК полимеразы калыбынан зондду гидролиздейт, репортер флуоресценттик тобун өчүрүүчү флуоресценттик тобунан бөлүп, флуоресценттик сигналды чыгарат.Зонд менен шаблондун ортосунда бирден-бир байланыш бар болгондуктан, сыноонун тактыгы жана сезгичтиги жагынан зонд ыкмасы боёк ыкмасынан жогору турат.Зонд ыкмасы негизинен диагностикада колдонулат.

С: Абсолюттук сандык көрсөткүч деген эмне?Салыштырмалуу сандык аныктоо деген эмне?

Жооп: Абсолюттук сандык аныктоо qPCR тарабынан текшериле турган үлгүнүн баштапкы көчүрмө санын эсептөөнү билдирет, мисалы, 1 мл канда канча HBV вирусу бар.Салыштырмалуу сандык аныктоонун натыйжасында алынган натыйжа башка эталондук үлгүгө салыштырмалуу конкреттүү үлгүдөгү максаттуу гендин өлчөмүнүн өзгөрүшү жана гендин экспрессиясы жогору же төмөндөйт.

С: РНК экстракциясынын көлөмү, тескери транскрипциянын эффективдүүлүгү жана күчөтүү эффективдүүлүгү эксперименталдык натыйжаларга таасир этеби?
С: Үлгүлөрдү сактоо, экстракция реагенттери, тескери транскрипция реагенттери жана жарык өткөрүүчү сарпталуучу материалдар эксперименттин натыйжаларына таасирин тийгизеби?
С: Эксперименттик маалыматтарды кандай ыкма менен оңдоого болот?

Бул маселелерге байланыштуу биз аларды төмөнкү өркүндөтүлгөн жана өркүндөтүлгөн бөлүмдөрдө кеңири сүрөттөп беребиз.
2. Жогорку билим

Чыныгы убакыт режиминдеги флуоресценттик сандык ПТРге келсек, биз жыл сайын миңдеген илимий изилдөөлөр жарыяланат, алардын арасында флуоресценттик сандык ПТР технологиясы аз санда эмес экенин түшүнүшүбүз керек.

Эгерде флуоресценттик сандык ПТР экспериментин өлчөө үчүн бирдиктүү стандарт жок болсо, натыйжалар ар кандай болушу мүмкүн.Бир эле түрдүн бир гени үчүн, бир эле иштетүү ыкмасы менен, аныктоонун натыйжалары да ар түрдүү болот жана кеч келгендер үчүн ошол эле жыйынтыктарды кайталоо кыйынга турат.Сиз кайсынысы туура, кайсынысы туура эмес экенин эч ким билбейт.

Бул флуоресценттик сандык ПТР алдамчы технология же ишенимсиз технология дегенди билдиреби?Жок, себеби флуоресценттик сандык ПТР кыйла сезгич жана так жана бир аз туура эмес операция такыр карама-каршы натыйжаларды берет.Кичинекей жоготуу миң чакырым алыстыкта ​​турат.Рецензенттер тарабынан макаланын автору кайра-кайра кыйноого алынышы мүмкүн.Ошол эле учурда, журналдын рецензенттери да ар кандай эксперименталдык натыйжалардан тандоо кыйын.

Жалпысынан алганда, реалдуу убакыт ПТР эксперименттеринде консенсустун жоктугун көрсөтүп турат.Ушул максатта тармактын улуу окумуштуулары стандарттарды түзө башташты,бул стандарттарга жооп берүү үчүн макалада кээ бир зарыл болгон эксперименталдык жана маалыматтарды иштетүү деталдарын (анын ичинде зарыл болгон маалыматтарды) камсыз кылуу үчүн салым кошуучуларды талап кылат.

Рецензенттер бул деталдарды окуу менен эксперименттин сапатын баалай алышат;келечектеги окурмандар экспериментти кайталоо же экспериментти жакшыртуу үчүн да колдонсо болот.Ошондо ушундай жол менен алынган эксперименттик натыйжалар толук маалымат, жогорку сапаттагы жана колдонууга болот.

MIBBI (Биологиялык жана биомедициналык изилдөөлөр үчүн минималдуу маалымат -http://www.mibbi.org) пайда болгон.MIBBI эксперименттер үчүн стандарттарды камсыз кылган долбоор болуп саналат.Ал табиятта жарыяланган.Бул долбоор ар кандай биологиялык эксперименттерге багытталган, анын ичинде клетка биологиясы, Microarray, qPCR, биз азыр талкуулайбыз ж.б. жана кол жазмаларды тапшырууда эксперименттин ар бир түрүн караштырат.Бул маалымат ар дайым берилиши керек.

MIBBI долбоорунда флуоресценттик сандык ПТРге байланыштуу эки макала бар, атап айтканда:
·RDML (Real-Time PCR Data Markup Language) – реалдуу убакыттагы сандык ПТР маалыматтары үчүн структураланган тил жана отчеттук колдонмо;
·MIQE (ПЧРнын сандык эксперименттерин жарыялоо үчүн минималдуу маалымат) – реалдуу убакыт режиминдеги сандык ПТР эксперименттери жөнүндө макалаларды жарыялоо үчүн минималдуу маалымат.
Биринчиден, RDML, терминология спецификациясы жөнүндө сүйлөшөлү.

Эгерде бардыгы үчүн стандарттуу аныктама жок болсо, талкууну улантуу мүмкүн эмес, ошондуктан экзаменде терминдерди түшүндүрүү абдан маанилүү.
Флуоресценттик сандык ПТР экспериментинде колдонулган терминология төмөнкү мазмунду камтыйт.QIAGEN биз үчүн эң жакшы корутундуну жасады.Төмөнкүлөрдүн баары кургактоварлар .

Күчөтүү ийри сызыгы
Күчөтүү ийри сызыгы ПТР процессинде жасалган ийри сызыкты билдирет, цикл номери абсцисса жана реалдуу убакыттагы флуоресценция интенсивдүүлүгү реакция учурунда ордината катары.

Мыкты күчөтүү ийри төмөнкү мүнөздөмөлөргө ээ болушу керек: базалык сызык жалпак же бир аз төмөндөгөн жана ачык өсүү тенденциясы жок;ийри сызыктын ийилүүчү чекити ачык-айкын, ал эми экспоненциалдык фазанын эңкейиши күчөтүү эффективдүүлүгүнө пропорционалдуу.эңкейиш канчалык чоң болсо, күчөтүү эффективдүүлүгү ошончолук жогору болот;жалпы күчөтүү ийри сызыгы Параллелизм жакшы, бул ар бир түтүктүн күчөтүү эффективдүүлүгү окшош экендигин көрсөтүп турат;аз концентрациялуу үлгүлөрдү күчөтүү ийри экспоненциалдык фазасы ачык көрүнүп турат.

Базалык (базалык)
Баштапкы циклдин ызы-чуу деңгээли, адатта 3-жана 15-циклдин ортосунда өлчөнөт, анткени күчөтүү продуктунун флуоресценттик маанисинин жогорулашын бул мезгилде аныктоо мүмкүн эмес.Базалык көрсөткүчтү эсептөө үчүн колдонулган циклдердин саны ар кандай болушу мүмкүн жана эгерде шаблондун жогорку өлчөмдөрү колдонулса же максаттуу гендин экспрессия деңгээли жогору болсо, кыскартуу керек болушу мүмкүн.

Негизги линияны коюу үчүн сызыктуулукту күчөтүү ийри сызыгынан флуоресценция маалыматтарын көрүү талап кылынат.Базалык сызык күчөтүү ийри сызыгынын өсүшү базалык циклдин жогорку санынан чоңураак цикл номеринен башталышы үчүн орнотулган.Базалык көрсөткүчтөр ар бир максаттуу ырааттуулук үчүн өзүнчө белгилениши керек.Эрте циклдерде аныкталган флуоресценциянын орточо маанисин күчөтүлгөн продуктыларда алынган флуоресценттик маанилерден алып салуу керек.Ар кандай Real-Time PCR программалык камсыздоонун акыркы версиялары жеке үлгүлөр үчүн баштапкы орнотууларды автоматтык түрдө оптималдаштырууга мүмкүндүк берет.

ПТР күчөтүү реакциясынын алгачкы бир нече циклдеринде флуоресценция сигналы көп деле өзгөрбөйт.Түз сызыкка жакындоо базалык сызык деп аталат, бирок биз биринчи бир нече циклди жакшылап карасак, анда төмөнкү сүрөттө эмне болуп жатканын көрө алабыз.

Фондук Фон дегенди билдирет
реакциядагы спецификалык эмес флуоресценция мааниси.Мисалы: эффективдүү эмес флуоресценттик өчүрүү;же SYBR Гринди колдонуудан улам көп сандаган кош саптуу ДНК шаблондору.Сигналдын фон компоненттери реалдуу убакыттагы ПТР программалык алгоритми тарабынан математикалык түрдө алынып салынат.

Кабарчынын сигналы
Репортер сигналы SYBR Green же флуоресценттик белгиленген ырааттуулугу боюнча спецификалык зонддор тарабынан түзүлгөн флуоресценттик сигналга тиешелүү.

Нормалдаштырылган кабарчы сигналы (RN)
RN кабарчы боёктун флуоресценция интенсивдүүлүгүн ар бир циклде өлчөнгөн пассивдүү эталондук боёктун флуоресценция интенсивдүүлүгүнө бөлгөндүгүн билдирет.

Пассивдүү шилтеме боёгу
Кээ бир реалдуу убакыттагы ПТРлерде,флуоресценттик боёк ROX флуоресценттик сигналды нормалдаштыруу үчүн ички шилтеме катары колдонулат.Ал скважиналардын так эместигинен, скважиналардын абалынан жана флуоресценциянын термелүүсүнөн улам болгон вариацияларды скважинанын негизинде оңдойт.

Флуоресценттик босого (босого)
Фондук мааниден жогору жана күчөтүү ийри сызыгынын плато маанисинен кыйла төмөн жөнгө салынды.Ал ПТР аныктоонун лог-сызыктуу диапазонун чагылдырган күчөтүү ийри сызыгынын сызыктуу аймагында жатышы керек.ПТРдин лог-сызыктуу фазасын оңой аныктоо үчүн босоголор лог-күчөтүү ийри сызыгынын көрүнүшүндө коюлушу керек.Эгерде Real-Time ПТРде бир нече максаттуу гендер бар болсо, босого ар бир максат үчүн коюлушу керек.Негизинен, флуоресценттик фон сигналы катары ПТР реакциясынын алгачкы 15 циклинин флуоресценция сигналы колдонулат, ал эми флуоресценция босогосу ПТРдин биринчи 3-15 циклинин флуоресценция сигналынын стандарттык четтөөсүнөн 10 эсе көп, ал эми флуоресценция босогосу PCRдин эксплуатация фазасында орнотулган.Жалпысынан алганда, ар бир инструменттин флуоресценттик босогосу колдонуудан мурун коюлган.

Цикл босогосу (КТ) же өтүү чекити (CP)
Күчөтүү ийри сызыгы босогону кесип өткөн цикл (б.а. флуоресценцияны аныктоо кыйла жогорулаган чекит).КТ бөлчөк болушу мүмкүн жана баштапкы шаблондун көлөмүн эсептөөгө болот.КТ мааниси ар бир ПТР реакциясынын түтүкчөсүндөгү флуоресценттик сигнал белгиленген чекке жеткенде болгон циклдердин санын билдирет.Ар бир калыптын КТ мааниси менен шаблондун баштапкы көчүрмө номеринин логарифминин ортосунда сызыктуу байланыш бар.баштапкы көчүрмөнүн саны жогору болсо, КТ мааниси ошончолук аз болот жана тескерисинче.Стандарттык ийри сызыкты белгилүү баштапкы көчүрмө номери бар стандартты колдонуу менен түзсө болот, мында абсцисса CT маанисин, ал эми ордината баштапкы көчүрмөнүн санынын логарифмасын билдирет.Демек, белгисиз үлгүнүн КТ мааниси алынганда, үлгүнүн баштапкы көчүрмөсүн стандарттык ийри сызыктан эсептөөгө болот.

ΔCT мааниси
ΔCT мааниси сүрөттөйтмаксаттуу ген менен тиешелүү эндогендик шилтеме ген КТ маанисинин ортосундагы айырма, мисалы, үй чарба гени жана колдонулган шаблондун көлөмүн нормалдаштыруу үчүн колдонулат:
⇒ΔCT = CT (максаттуу ген) – CT (эндогендик шилтеме ген)

ΔΔCT Value
ΔΔCT мааниси кызыккан үлгүнүн орточо ΔΔCT мааниси (мисалы, стимулданган клеткалар) менен маалымдама үлгүсүнүн орточо ΔΔCT маанисинин (мисалы, стимулдаштырылбаган клеткалар) ортосундагы айырманы сүрөттөйт.Маалымдама үлгүсү калибрлөө үлгүсү деп да аталат жана башка бардык үлгүлөр салыштырмалуу сандык аныктоо үчүн нормалдаштырылган:
⇒ΔΔCT = орточо ΔCT (кызыкчылык үлгүсү) – орточо ΔCT (маалымдама үлгү)

Эндогендик шилтеме гендер (эндогендик референт гендер)
Үй чарба гендери (үй чарба гендери) сыяктуу эндогендик референт гендердин экспрессия деңгээли үлгүлөр арасында айырмаланбайт.Эталондук гендин КТ маанилерин максаттуу генге салыштыруу максаттуу гендин экспрессия деңгээлин киргизүү РНКсынын же cDNAнын көлөмүнө нормалдаштырууга мүмкүндүк берет (жогоруда ΔCT маанилери боюнча бөлүмдү караңыз).

Ички шилтеме гендер үчүн туурамүмкүн болгон РНК деградациясы же РНК үлгүлөрүндө фермент ингибиторлорунун болушу, ошондой эле РНКнын мазмунунун вариациялары, тескери транскрипциянын эффективдүүлүгү, нуклеин кислотасынын калыбына келиши жана үлгүлөрдү иштетүү.Оптималдуу маалымдама генин(-терин) тандоо үчүн, биз алгоритмди эксперименттик орнотууга жараша оптималдуу шилтемени тандоого мүмкүндүк берүү үчүн өзгөрттүк.

Ички көзөмөл
Максаттуу ырааттуулук менен бирдей реакцияда күчөтүлгөн жана башка зонд менен текшерилген башкаруу ырааттуулугу (б.а., дуплекстүү ПТР жүргүзүү).Ички контроль көбүнчө ийгиликсиз күчөтүүлөрдү жокко чыгаруу үчүн колдонулат, мисалы, максаттуу ырааттуулук аныкталбаганда.
Калибрлөө үлгүсү
Гендин салыштырмалуу экспрессия деңгээлин аныктоо үчүн бардык башка үлгүлөрдү салыштыруу үчүн салыштырмалуу сандык аныктоодо колдонулган маалымдама үлгүсү (мисалы, клетка линиясынан же кыртыштан тазаланган РНК).Калибрлөө үлгүсү ар кандай үлгү болушу мүмкүн, бирок көбүнчө контролдук болуп саналат (мисалы, тазаланбаган үлгү же эксперименттин нөл убактысынан алынган үлгү).

Позитивдүү башкаруу
менен башкаруу реакцияларын колдонуукалыптардын белгилүү өлчөмдөрү.Позитивдүү башкаруу элементтери көбүнчө праймер топтому же праймер-зонд топтому туура иштеп жатканын жана реакциянын туура орнотулгандыгын текшерүү үчүн колдонулат.

Үлгү башкаруусу жок (NTC)
Адатта суу менен алмаштырылуучу шаблондон башка күчөтүү реакциясынын бардык керектүү компоненттерин камтыган башкаруу реакциясы.NTC колдонуу реагенттин булганышы же чет элдик ДНК менен шартталган булганууну таба алат, ошентип аныктоо маалыматтарынын аныктыгын жана ишенимдүүлүгүн камсыз кылат.NTC контролунун күчөшү булганганын көрсөтөт.

RT көзөмөлү жок (NRT)
РНК экстракция процессинде калдык геномдук ДНК камтылышы мүмкүн, ал өтө зыяндуу жана маалыматтардын сапатына жана qPCRдин табигый душманына таасир этет, ошондуктан эксперименттерди иштеп чыгууда ал РНКны аныктоону күчөтүү үчүн гана иштелип чыгышы керек.Эки жол бар, бири интрондор боюнча праймерлерди долбоорлоо, экинчиси ДНКны толугу менен жок кылуу, кайсынысы жакшыраак, бул тууралуу кийинчерээк талкууланат.NTR башкаруу ДНКнын булганышын аныктоо үчүн сыйкырдуу күзгү болуп саналат.Эгерде күчөтүү бар болсо, бул булгануу бар дегенди билдирет.

Стандарттар
Стандарттар - стандарттуу ийри сызыкты куруу үчүн колдонулган белгилүү концентрациясынын үлгүлөрү же көчүрмө саны.Стандарттын туруктуулугун камсыз кылуу үчүн ген фрагменти адатта плазмидге клондолуп, стандарт катары колдонулат.

Стандарттык ийри сызык
адатта эки эселенген катышка ылайык стандарттуу продукту менен жок дегенде 5 концентрация градиентине суюлтулуп, CT маанисинин координаталарында жана көчүрмө номеринде 5 чекит тартылып, чекиттер стандарттуу ийри сызыкты түзүү үчүн сызык түзүү үчүн бириктирилет.Ар бир стандарттуу ийри сызык үчүн анын жарактуулугун текшерүү керек.Жантаюунун мааниси –3,3 жана –3,8 ортосунда болот жана ар бир концентрация үч нускада аткарылат.Башка пункттардан бир топ айырмаланган пункттарды алып салуу керек.Текшере турган үлгүнүн КТ мааниси стандарттык ийри сызыкка келтирилет жана текшериле турган үлгүнүн экспрессия деңгээли эсептелиши мүмкүн.

Текшере турган үлгүнүн КТ мааниси стандарттык ийри сызыгына келтирилет жана текшериле турган үлгүнүн баштапкы нускасынын саны эсептелиши мүмкүн.

Натыйжалуулук жана эңкейиш
Стандарттык ийри сызыктын эңкейиши реалдуу убакыт ПТРдин эффективдүүлүгүн көрсөтөт.
· Эңкейиш -3,322 ПТР күчөтүү эффективдүүлүгү 1 же 100% эффективдүү экенин жана ар бир циклде ПТР продуктунун көлөмү эки эсеге көбөйөрүн көрсөтөт.
· –3,322ден (мисалы, –3,8) азыраак эңкейиш ПТР эффективдүүлүгүн көрсөтөт
· –3,322ден чоңураак эңкейиш (мисалы, –3,0) ПТР эффективдүүлүгү 100%дан жогору экенин көрсөтүп турат, бул кызык, ПТРдин бир цикли кантип күчөтүлгөн продуктуну эки эседен ашык жаратышы мүмкүн?Бул жагдай ПЦР реакциясынын сызыктуу эмес фазасында пайда болот, башкача айтканда, көп сандагы спецификалык эмес күчөтүү бар.

эрүү ийри
qPCR күчөтүү аяктагандан кийин, ПТР продуктусу ысытылат.Температура жогорулаган сайын, эки катарлуу күчөтүү продуктусу акырындык менен эрип, флуоресценциянын интенсивдүүлүгүнүн төмөндөшүнө алып келет.Белгилүү бир температурага (Тм) жеткенде көп сандагы продукция эрийт.Флуоресценция кескин төмөндөйт.Ар кандай ПТР продуктулары ар кандай Tm баалуулуктарына жана ар кандай эрүү температураларына ээ, ошондуктан ПТРдин өзгөчөлүгүн аныктоого болот.

Эрүү ийри сызыгы (туунду ийри сызыгы)
Эрүү ийри сызыгы ПЦР продуктунун фрагменттеринин абалын интуитивдик түрдө чагылдыра турган чоку картасын түзүү үчүн алынган.Эрүү температурасы ДНК фрагментинин Tm мааниси болгондуктан, ДНК фрагментинин Tm маанисине таасир этүүчү кээ бир параметрлерди, мисалы, фрагменттин өлчөмү, GC мазмуну ж.күчөтүлгөн продуктунун узундугу 80-300bp диапазонунда, ошондуктан эрүү температурасы 80 ° C жана 90 ° C ортосунда болушу керек.

Эрүү ийри сызыгынын интерпретациясы: Эгерде бир гана негизги чокусу 80°C-90°C ортосунда пайда болсо, бул флуоресценттик сандык ПТР идеалдуу экенин билдирет;негизги чокусу 80 ° C-90 ° C ортосунда пайда болсо жана ар кандай чокулары 80 ° C төмөн пайда болсо, праймер димер негизинен каралат.Сиз аны чечүү үчүн annealing температурасын жогорулатууга аракет болот;эгерде негизги чоку 80°C-90°C арасында пайда болсо, ал эми ар кандай чоку температура көтөрүлгөндө кайра пайда болсо, анда негизинен ДНКнын булганышы бар деп эсептелет жана ДНКны эксперименттин баштапкы этабында алып салуу керек.

Албетте, дагы эле анормалдуу жагдайлар бар, алар төмөндө бир-бирден бөлүнөт.
3. Жогорку билим

qPCR кылуу үчүн, мен MIQE деп айтышым керек,Минималдуу маалыматжарыялоо үчүнСандыкРеалдуу убакыттагы ПТРЭксперимент - реалдуу убакыттагы сандык ПТР жөнүндө макалаларды жарыялоо үчүн минималдуу маалыматэксперименттер.Ар бир адамдын түшүнүүсүн жөнөкөйлөтүү үчүн, биз негизги мазмунду жөнөкөйлөштүрөбүз.

MIQEнин түпнуска текстин Интернеттен издесеңиз болот, эң негизгиси андамакаланы жарыялоодо берилиши керек болгон маалыматтарды текшерүү тизмеси .

Рецензенттер бул деталдарды окуу менен эксперименттин сапатын баалай алышат;келечектеги окурмандар да муну кайталап же экспериментти жакшыртуу үчүн колдоно алышат.
Бул тизмеде ар бир тизменин маанилүүлүгү тиешелүүлүгүнө жараша E же D менен белгиленгендигин белгилей кетүү керек.Ал эмнени билдирет?E: маанилүү маалымат (тапшыруу керек);D: керектүү маалымат (мүмкүн болушунча көбүрөөк камсыз кылуу).

MIQE (1) — Эксперименталдык долбоорлоо
Аспирантураны бүтүргөндөн кийин коргоосун бүтүргөн көптөгөн шылуундар өз алдынча эксперимент түзүүнү, дептерин ачканды жана мугалимдин айтканын аткарганды билишпейт.Натыйжада эксперименталдык долбоор катуу эмес, журналдын редакциясы бул сүрөттү жана тигил сүрөттү жасагысы келгендиктен, аны таң калып жасашканын айтышты.Акылсыздарды ушинтип жасашат!

Үйгө жакыныраак, эксперименттин биринчи принциби аныктоо болуп саналатэксперименталдык логиканын катуулугу.Эң негизгиси эксперименталдык долбоор болуп саналат, ал эми эксперименталдык долбоордо эң негизгиси эксперименталдык маалыматтар шилтеме, салыштыруу жана ынандырарлык болушу үчүн максаттуу үлгүнү, эталондук үлгүнү (контролдоо) жана кайталоолордун санын кантип коюу керек.

Максаттуу үлгүбелгилүү бир дарылоодон кийин максаттуу генди аныктоону талап кылган үлгүнү билдирет.Маалымдама үлгүсүэч кандай дарылоосуз үлгү болуп саналат, ал көбүнчө биологияда жапайы түрү деп аталат.

Эксперименттик көчүрмөлөрабдан маанилүү болуп саналат.Жалпысынан алганда, ынандыруучу кайталоолордун саны үчтөн көп болушу керек.Биологиялык репликация эмне, техникалык репликация эмне экенин ажыратып билүү керек.

Биологиялык репликалар: Ошол эле текшерүү эксперименти ар кандай материалдар менен жасалган (убакыт, өсүмдүктөр, партиялар, реакция плиталары).

Биологиялык дупликация
Мисал катары калемпирди пестициддер менен дарылоону алалы.Биз ABC үч өсүмдүккө пестициддерди чачкыбыз келет, анда ABC үч өсүмдүктөрү үч биологиялык көчүрмө болуп саналат жана алар ар кандай материалдар менен жүргүзүлгөн бир эле текшерүү эксперименти болуп саналат.Бирок эксперимент катары сөзсүз түрдө контроль керек, ошондуктан биз А өсүмдүктүн бир бутактарынын бирине чачыратып А өсүмдүктүн эксперименталдык тобун түзө алабыз, ал эми А өсүмдүктүн башка бутактарына контролдук топту чачпайбыз.B жана C үчүн да ушундай кыл.

Техникалык копиялар (техникалык копиялар): Бул иш жүзүндө каталарды болтурбоо үчүн иштелип чыккан кайталанган эксперимент болуп саналат, ал иш жүзүндө бир эле материалда камтылган кайталанган тешик болуп саналат.Дарылоодо да, башкарууда да максаттуу гендин жана ички маалымдама генинин репликацияланган орнотуулары (кеминде үч) болушу керек.

Техникалык кайталоо
Дагы бир мисал катары пестициддер менен дарыланган калемпирди алалы.А өсүмдүктүн эксперименталдык тобу үчүн анын максаттуу гени жана ички маалымдама гени үчүн 1, 2 жана 3 үч ПТР тешиктерин ачкандан кийин орточо эсепти алуу үчүн жасадык.Өсүмдүк А топторун көзөмөлдөө үчүн да ушундай жол менен мамиле кылынат.Ошо сыяктуу эле, B жана C өсүмдүктөрү үчүн ушундай эле дарылоо.Бул техникалык кайталоо.

деп белгилей кетуу керекСтатистикага кире турган нерсе бул биологиялык кайталоо, ал эми техникалык кайталоо эксперименталдык процессте кандайдыр бир кокус кубулуштардын бар-жоктугун текшерүү, эксперименттин жыйынтыгын ишенимдүү кылуу, б.а. биз көп айткандай алардын орточо маанисин алуу менен каталарды болтурбоо үчүн.

Терс көзөмөл – NTC жана NRT
NTC (Шаблонсуз башкаруу), үлгүсү жок башкаруу эксперименталдык материалдын булганганын текшерүү үчүн колдонулат.Негизинен, суу шаблон катары колдонулат.Эгерде флуоресценттик реакция болсо, бул лабораторияда нуклеин кислотасынын булганышы болгонун көрсөтөт.

Бул булгануулар: таза эмес суудан, эндогендик ДНКны камтыган квалификациялуу эмес реагенттерден, праймердик булгануудан, лабораториялык жабдуулардан, аэрозольдук булгануудан, ж.Аэрозолдук булганууну табуу эң кыйын.Сиздин лабораторияны абада ар кандай нуклеиндик кислоталар турган түтүн сыяктуу элестетиңиз.

NRT (Кайрымсыз транскриптаза), тескери транскрипциясы жок башкаруу, терс башкаруу катары тескери транскрипцияланган РНК, бул гДНК калдыктарын көзөмөлдөө.

Ген экспрессиясын жасап жатканда, РНКнын саны тескери транскрипциядан кийин кДНКнын көлөмүн аныктоо аркылуу аныкталат.Эгерде РНК тазаланганда гДНК калдыктары бар болсо, ал эксперименттин натыйжаларында каталарды жаратат, анткени чыныгы алынган натыйжалар gDNA жана cDNA болуп саналат.Жалпы деъгээлде, жөн гана cDNA эмес, гДНК РНКны экстракциялоо учурунда толугу менен жок кылынышы керек.

MIQE (2) — үлгү маалымат
Үлгү маалымат деп аталган нерсе, биз qPCR жөнүндө макаланы жарыялоодо, биз макаланын ажырагыс бөлүгү болгон үлгүдөгү маалыматты так түшүндүрүшүбүз керек дегенди билдирет.Ошо сыяктуу эле, биз үлгүлөрдү иштеп жатканда, биз да үлгүлөрдүн жарактуулугун камсыз кылуу үчүн өзүбүздүн операцияларды жөнгө салуу керек.

Үлгүнүн сүрөттөлүшү бир гана натыйжа болуп саналат жана биз бүт эксперимент учурунда алынган материалдарга көбүрөөк көңүл бурушубуз керек.

Эксперименттик материалдарды тандоо
Кан үлгүлөрү – жаңы канды тандаңыз, 4 сааттан ашык эмес.Клетка үлгүлөрү - күчтүү өсүү мезгилинде жаңы клеткаларды чогултууну тандашат.Жаныбарлардын кыртыштары - жаңы, күчтүү өскөн кыртыштарды тандаңыз.Өсүмдүк кыртыштары – жаңы, жаш кыртыштарды тандаңыз.

Бул бир нече сүйлөмдөрдүн ичинде негизги сөз бар экенин байкасаңыз керек: жаңы .
Жогорудагы үлгүлөр үчүн, рынокто эң жакшы, үнөмдүү жана туруктуу комплект - бул Foregene комплекти, ал ДНК менен РНКны тез жана оңой чыгарып алат.

Кан ДНК мини комплект

Клетканын жалпы РНК изоляциясынын комплекти

Жаныбарлардын жалпы РНК изоляциясынын комплекти

Өсүмдүктөрдүн жалпы РНК изоляциясынын комплекти

Plant Total RNA Isolation Kit Plus

Өсүмдүктөрдүн ДНК изоляциясынын комплекти

Эксперименталдык материалдарды сактоо
Жалпысынан алганда, эгерде шарттар уруксат берсе, биз үлгүлөрдү сактоону сунуш кылбайбыз.Бирок, үлгү алгандан кийин дароо эксперимент жүргүзө албаган көптөгөн достор бар, ал тургай кээ бирлери үлгү алуу үчүн суюк азот бактарын талаага алып барышы керек.

Мындай эмгекчил досум үчүн мен сиз реагенттин сарпталуучу материалдарын түшүнбөйсүз деп гана айта алам.Азыр көптөгөн реагенттер керектелүүчү компаниялар РНК үлгүлөрүн бөлмө температурасында сактай турган реагенттерди чыгарышат жана сиз аларды колдонууну тандай аласыз.Кадимки сактоо ыкмасы суюк азотту сактоо, аны алып жүрүүгө оңой болгон кичинекей суюк азот бактарын колдонуу.Үлгүнү кайра лабораторияга алып келгенден кийин, аны -80°C муздаткычта сактаңыз.

РНКны камтыган эксперименттер үчүн алты сөздүк принцип сакталышы керек:төмөн температура, ферменттер жок,жанатез .

Төмөн температура түшүнүгүн түшүнүү оңой;ферменттерсиз, RNase биз жашап жаткан дүйнөнүн бардык жеринде бар (антпесе сиз ВИЧтен өлүп калмаксыз), андыктан эксперименттерди жасап жатканда RNase кантип сактануу керек - бул абдан маанилүү түшүнүк;тез,Дүйнөдө сынбай турган кунг-фу жок, бир гана ылдамдык бузулбайт.

Ошондуктан, кандайдыр бир мааниде, казып алуу убактысы канчалык кыска болсо, комплект ошончолук жакшы.ЭмнегеForegeneкомплект ылдамдыкты баса белгилейт, анткени алар муну жакшы билишет.

PS: Кээ бир кыздар эксперименттерди өтө кылдаттык менен жасашат, бирок алар бир нече жыл иштегенден кийин слем-данк сыяктуу жакшы эмес.Алар Кудайды адилетсиз деп эсептеп, башкалардын үстүнөн арызданышат жана өмүрдү издешет.Чынында, ал муну түшүнгөн жок.Ал РНКны жакшы коргой алган жок, слем-данк оюнчусу шамдагай эле.Тажрыйба жасап жатканда ал слем-данкты үч жолу, беш жолу жана эки бөлүү менен бүтүрөм деп ойлогон, бирок экспериментти жакшы аткарган.

Эскертүү: Жайыраак, RNase басып алуу мүмкүнчүлүгү көбүрөөк.Кантип өзүңүздү тез болууга үйрөтүү керек?Эч кандай жол жок, жөн гана көбүрөөк машыгуу.

Ар кандай эксперименттер жана ар кандай үлгүлөр үчүн дагы эле көбүрөөк адабияттарды окуп, кайра иштетүү үчүн ылайыктуу ыкманы тандоо керек.Үлгүлөрдү чогултуу жана сактоо процесси үчүн MIQE ал кагазга так жазылышын талап кылат, ошондуктан рецензенттер кагаздын ишенимдүүлүгүн карап чыгышы үчүн, ошондой эле таң калган жаштарга сиздин экспериментиңизди кайталоо ыңгайлуу.

Биологиялык эксперименттер кыйын болсо да, алар жогорку деңгээлде.Сак болбосоң, дүйнөнү оодарып аласың.Мисалы, SARSти биохимиялык кризиске айландыруу же 1,3 миллиард адамды сактап калуу үчүн гибрид күрүч жасоо.Төмөндөгү сүрөт химиялык эксперимент, анын дик сымал көрүнүшүн карап эле өзүңүздүн изилдөөңүзгө сыймыктанарыңызды түшүнүшүңүз керек.Аны унут, аны каралаба.

MIQE (3) – нуклеин кислотасын алуу.
Нуклеин кислотасын алуу чоң окуя жана бардык молекулярдык биология эксперименттери нуклеин кислотасын алуу менен башталат.Биринчиден, нуклеин кислотасын алуу боюнча MIQE мазмунун көчүрүп алалы.

Бул форманы карап туруп, бетинде тура албайсың.Форма догма болуп саналат.Мыкты студент болуу үчүн эмне үчүн деп суроо керек.Бул таблицанын негизги мазмуну: ИздөөРНКнын тазалыгы, бүтүндүгү, консистенциясы жана экстракция көлөмү .

Биринчи бөлүгүпроцесс же аспап нуклеин кислотасын алуу кадамы болуп саналат.Эгерде сиз экстракция үчүн автоматтык нуклеин кислотасын экстракторду колдонсоңуз (кеңири өнүккөн, сатып алуу үчүн мени менен байланышыңыз), сиз аспаптын моделинин атын көрсөтүшүңүз керек.

Комплекттин аты жана

өзгөртүү чоо-жайы үчүн кандай комплект колдонулганын, кандай атайын реагенттер кошулганын же кандай атайын операциялар жасалганын башкалар сиздин экспериментиңизди оңой кайталашы үчүн так түшүндүрүп берүү керек.

Кээ бирөөлөр атайын үлгүлөрдү алып жатканда атайын реагенттерди кошуп, бул алардын жашыруун куралы деп ойлоп, башкаларга айтпайт.Жашыруун бойдон калуу менен, макалаңызды жаркыратуу мүмкүнчүлүгүнөн да айрылышат.Акылдуу болбоңуз, илимий изилдөөдө өлкөнүн карыя Чжанга караганда чынчыл болушуңуз керек, эгер акылдуу болгуңуз келсе, макала сизди келесоо кылат.

комплект продукт номерин эстен чыгарбоо кереккомплектти заказ кылганда жана макала жазганда.Комплектте жалпысынан эки номер бар: Cat—каталог номери (продукциянын номери, макаланын номери), Лот—продукциянын лотунун номери (Өнүмдүн кайсы партиядан келгенин көрсөтүү үчүн колдонулат).

Кошумчалай кетсек, биохимиялык реагенттерге заказ берүүдө CAS номери көп колдонулат, мен аны чогуу жайылтам.CAS номери - Америка химиялык коому тарабынан ар бир жаңы химиялык дарыга берилген сан.Жалпысынан үч сан сызыкча менен туташтырылган.Рушуйдин CAS номери: 7732-18-5.Химиялык заттардын көбүнчө бир нече лакап аттары бар, бирок CAS номери уникалдуу.Дарыга буйрутма берип жатканда, адегенде анын CAS номерин текшерсеңиз болот.

Үйгө жакыныраак, эмне үчүн биз бул нерселерди так сүрөттөшүбүз керек?Чынында, бул РНК алуу сапатын текшерүү үчүн да болуп саналат.Приборлорду жана комплекттерди колдонуу РНКны экстракциялоону ырааттуураак кылат.Кадимки лабораториялардын экстракция масштабы чоң эмес, аны комплекттер менен алууга болот.

DNase же RNase дарылоонун чоо-жайы
Флуоресценттик сандык ПТРдин маанилүү маселеси ДНКнын булганышын алдын алуу болуп саналат жана булгануу бар болсо эксперимент жасабаңыз.Ошондуктан, эксперимент процессиндеги ДНКнын толугу менен жана толугу менен жок кылынганын көрсөтүү үчүн ДНКны иштетүү үчүн колдонгон процессти айтуу зарыл.схемалык диаграмма менен көрсөтүлгөн.

РНК менен ДНКнын схемалык диаграммасы
Жалпысынан алганда, ДНКны алып салуу ыкмасы экстракциядан кийин РНКны DNase менен дарылоо болуп саналат.Бирок, бул салыштырмалуу эски ыкмалар.Коммерциялык РНК экстракциялоо комплекттери экстракция процессинде ДНКны кошпостон ДНКны алып сала алды.Мисалы, Foregene комплекттеринин сериясы.

Эскертүү: РНКны экстракциялоодо ДНКны алып салуу өтө коркунучтуу эки миздүү кылыч, ал РНКны экстракциялоонун иштөө убактысын узартат жана РНКнын бузулуу коркунучун жогорулатат.Негизинен, бул РНКнын түшүмдүүлүгү менен тазалыгынын ортосундагы соода.

Мындан тышкары, кремний диоксидинин негизиндеги адсорбциялык колоннага кошулган DNase көлөмү өтө аз жана эффектке жетүү үчүн жогорку сапаттагы DNase колдонулушу керек.Оптимизацияланбаган DNase тез жана толук сиңирүү мүмкүн эмес.Бул соодагердин техникалык деңгээлин текшерүү.Албетте, ДНКны DNase жок эле алып салууга болот деп мактанган кызыктай соодагерлер дагы бар.ДНКны DNase жок эле алып салууга болот деп мактанган адам хулиган деп айтса болот.ДНК салыштырмалуу туруктуу эки тилкелүү түзүлүш жана аны сүйлөшүү жана күлүү менен жок кылуу мүмкүн эмес.

Контаминацияны баалоо
баалоо ыкмасы: электрофорезди аныктоо, 1% агароза, 6V/см, 15мин, жүктөө 1-3 ул.

Нуклеин кислотасынын сандык анализи
адатта UV спектрофотометрдин жардамы менен өлчөнөт.Адегенде OD260, OD280 жана OD230 үч баалуулуктарынын маанисин жайылтып берейин.
·OD260nm: Бул нуклеин кислотасынын эң жогорку жутуу чокусунун жутуу толкун узундугу жана эң жакшы өлчөнгөн маани 0,1ден 1,0го чейин.Болбосо, үлгүнү диапазонго жеткирүү үчүн суюлтуңуз же концентрациялаңыз.
·OD280nm: Бул белоктун жана фенолдук заттардын эң жогорку сиңирүү чокусунун жутуу толкун узундугу.
·OD230nm: Бул углеводдордун эң жогорку сиңирүү чокусунун жутуу толкун узундугу.

Андан ары ар бир көрсөткүчтүн ролу жөнүндө сөз кылалы.A260 үчүн, ал нуклеин кислотасынын түшүмүн өлчөө үчүн колдонулушу мүмкүн.OD260=1 болгондо, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml.

Тазалык үчүн биз көбүнчө көргөн катыштарды карашыбыз керек: OD260/280 жана OD260/230.
·Таза ДНК: OD260/280 болжол менен 1,8ге барабар.1,9дан жогору болсо РНКнын булганышы, 1,6дан аз болсо белок жана фенолдун булганышы бар экенин көрсөтөт.
· Таза РНК: 1.7
·OD260/230: ДНК же РНК болобу, маалымдама мааниси 2,5.2,0ден аз болсо, бул канттын, туздун жана органикалык заттардын булганышын билдирет.

РНКнын бүтүндүгү

РНКнын бүтүндүгүн өлчөө абдан маанилүү.Жалпысынан алганда, бул 28S жана 18S РНК ортосундагы жарыктык эки эсе байланыш экенин текшерүү үчүн РНК денатурация гел эксперимент жүргүзүү зарыл.Үчүнчү тилке 5S пайда болгондо, бул РНКнын омурткасыздардан башкасы бузула баштаганын билдирет.

РНКнын сапатын баалоо үчүн маалыматтар: Жогорудагы тесттерден тышкары, РНКнын бүтүндүгү жагынан дагы бир нече өркүндөтүлгөн аспап тесттери бар, мисалы Experion автоматтык электрофорез системасынын RQI бүтүндүгү тести, РНКнын көрүнбөй бузулгандыгын аныктай алат.

Илимий изилдөөдө флуоресценттик сандык ПТР максаттуу ген менен ички маалымдама гендин ортосундагы салыштыруу болуп саналат.Ошондуктан, РНК үлгүсүн сактоо процессинде, РНКны экстракциялоо ж.б., негизги максат РНКнын бүтүндүгүн камсыз кылуу болуп саналат.

РНКнын бүтүндүгү максаттуу ген менен ички шилтеме генинин ортосундагы тең салмактуулукка кандай таасир этээрин төмөндөгү сүрөттөн оңой түшүнүүгө болот.Деградация гендин толук эместигине алып келет, ал ички референт гендин толук эместигиби же максаттуу гендин толук эместигиби, айтор, ал маалыматтарга чоң таасирин тийгизет.

Максаттуу гендин жана шилтеме гендин схемалык диаграммасы чындыкка дал келбеши керек

Тоскоолдук сыноо (КТ мааниси жогорку же төмөн концентрацияда же башка шарттарда басылабы)

Бул көрсөткүчтү мисал катары алсак, беш ийри сызыктын Ct маанилери төмөнкүдөй.КТ маанилеринин ийри сызыктар ортосунда бөлүштүрүлүшү бир калыпта эмес, ал эми Ct маанилери жогорку жана төмөнкү концентрацияларда кечигип турат, бул ПТР бөгөт коюу учуру.

Негизги пункт: РНКны бөлүп алуу процессинде биз туура эмес түшүнүктөрдү таштап, туурасын түзүшүбүз керек.

Туура эмес идея: РНКны экстракциялоо кирешени гана көздөйт, РНК канчалык көп болсо, ошончолук жакшы деп ойлойт.Чындыгында биз сандык аныктоону жүргүзгөнүбүздө гендердин саны өтө көп болбосо, РНКнын көп деле кереги жок.Сиз чыгарып алган РНКнын көлөмү жетиштүү.

Туура түшүнүк болуп саналат:РНКны алуу тазалыкка, бүтүндүккө жана ырааттуулукка умтулушу керек.Тазалык кийинки тескери транскрипцияга бөгөт коюлбагандыгын жана маалыматтарга ДНКнын таасирин тийгизбей турганын камсыздай алат.Бүтүндүк максаттуу тизмектердин жана ички шилтемелердин тең салмактуулугун камсыздайт.Консистенция туруктуу үлгү жүктөөнү камсыз кылат.

MIQE (4) – тескери транскрипция
Жаңылыш түшүнүк: жогорку үлгү көлөмүнө умтулуу.
Туура түшүнүк: Жүктөлгөн РНКнын көлөмүнө карабастан, ырааттуулукту (туруктуулукту) көздөңүз, тескери транскрипциянын эффективдүүлүгү ырааттуу бойдон калууда, бул cDNAдагы айырмачылыктар мРНКдагы айырмачылыктарды чындап чагылдыра аларын камсыз кылуу.
Бул процессти схемалык диаграмма менен түшүндүрөбүз:

Тескери транскрипциянын эффективдүүлүгүнүн схемалык диаграммасы чындыкка дал келбейт
Биринчиден, биз тескери транскрипция процесси менен ПЦР процессинин ортосундагы айырманы түшүнүшүбүз керек.ПТР бир нече жылытуу жана күйдүрүү процесстеринен өтөт жана максаттуу фрагмент экспоненциалдуу түрдө өсөт;тескери транскрипцияда бул процесс жок болсо да, биз тескери транскрипцияны чындыгында бирден деп элестете алабыз.

Канчалык көп cDNA маалыматын ала турган болсо, муну азыр түшүнүү керек, анткени чоң-кичине фрагменттердин тескери транскрипцияланган жана бир фрагментке көңүл буруу мүмкүн эмес.Ал эми РНКнын көлөмү салыштырмалуу аз болгондуктан, алынган cDNAнын көлөмү да салыштырмалуу аз, ПТРден айырмаланып, күчөтүү эффектиси бар, ошондуктан аны аныктоо мүмкүн эмес.

cDNA электрофорез натыйжалары
Экинчиден, идеалдуу түрдө, тескери транскрипция бирден-бир аткарылат, бирок эч кандай компаниянын тескери транскриптазасы бул эффектке жете албайт.Негизинен, көпчүлүк тескери транскриптазалардын эффективдүүлүгү 30-50% га чейин өзгөрөт.Андай болсо, биз салыштырмалуу туруктуу тескери транскрипциянын эффективдүүлүгүнө ээ болгубуз келет, муну биз сүрөттө көргүбүз келет: 3 РНК 2 cDNA алат, 6 РНК 4 cDNA алат, ошондуктан үлгү канчалык жүктөлбөсүн, тескери транскрипциянын эффективдүүлүгү салыштырмалуу туруктуу.Биз тескери транскрипциянын эффективдүүлүгү туруксуз жана жогорку концентрацияга бөгөт коюлган кырдаалды көргүбүз келбейт.

Ошентип, тескери транскрипциянын натыйжалуулугу туруктуу экендигин кантип текшерүү керек?Метод абдан жөнөкөй, сиз болгону салыштыруу тестин жасашыңыз керек: бири РНКны эки эселенген суюлтуудан кийин кДНКга тескери транскрипциялоо, экинчиси cDNAга тескери транскрипциялоодон кийин эки эселенген суюлтуу, андан кийин алынган эңкейишти көрүү үчүн qPCR жүргүзүү.Мыкты студент катары сиз аны секунданын ичинде түшүнүшүңүз керек.Төмөндө көрсөтүлгөндөй:

Тескери транскрипциянын эффективдүүлүгү туруктуу экендигин текшерүү үчүн РНК менен кДНКны суюлтуу
Тескери транскриптаза жана комплект
Кантип кемчиликсиз флуоресценттик сандык ПТР сонун тескери транскриптазага жана комплектке ээ болот.Тескери транскриптаза булагы боюнча болжол менен эки түргө бөлүнөт, AMV жеM-MLV, жана алардын көрсөткүчтөрү таблицада көрсөтүлгөндөй.

RNase H активдүүлүгү
RNase H - Рибонуклеаза Н, кытайча аталышы - рибонуклеаза Н, ал ДНК-РНК гибриддик чынжырында РНКны атайын гидролиздей ала турган эндорибонуклеаза.RNase H бир же эки тилкелүү ДНКдагы же РНКдагы фосфодиэфир байланыштарын гидролиздей албайт, башкача айтканда, бир же эки тилкелүү ДНКны же РНКны сиңире албайт.КДНКнын экинчи тилкесин синтездөөдө көбүнчө колдонулат.

Бул кызык нерсе.Биз тескери транскриптаза RNase H активдүүлүгүнө ээ деп айтабыз, тескерисинче, тескери транскриптазада RNase H камтылган эмес жана RNase H-ны тескери транскриптазадан бөлүү мүмкүн болбой калышы мүмкүн, балким, тескери транскриптазада айрым топтордун конформациясынан улам, бул активдүүлүк тескери транскриптазадан келип чыгат.

Ошондуктан, AMV жогорку тескери транскрипция натыйжалуулугун карабастан, анын RNase H активдүүлүгү кДНКнын түшүмүн азайтат.Албетте, реагенттерди өндүрүүчүлөр cDNAнын түшүмүн жогорулатуу үчүн мүмкүн болушунча тескери транскриптазадагы RNase H активдүүлүгүн жок кылуу үчүн өз өнүмдөрүн оптималдаштырып жатышат.
Жылуулоо температурасы

РНКнын ар кандай температурадагы экинчилик структурасы
Ар кандай температурадагы РНКнын экинчилик структурасы үчүн жогорудагы сүрөттү караңыз жана mFold онлайн куралын колдонуп, белгилүү бир температура жана туз концентрациясынын шарттарында максаттуу фрагменттин экинчилик структурасын аныктаңыз.55°Сде РНКнын экинчилик структурасы дагы эле өтө татаал, тескери транскриптаза иштей албайт жана экинчилик структура 65°Сге чейин толук чечилбейт, ал эми AMV жана M-MLVнин оптималдуу температурасы бул температурадан алда канча төмөн.
эмне кылуу керек?Экинчи структура - бул шаблондун өзүн толуктоочу жупташтыруу, бул праймер менен тескери транскриптаза менен шаблондун ортосунда күчтүү атаандаштыкка алып келет, натыйжада E төмөн жана начар кайталануу сыяктуу бир катар көйгөйлөр пайда болот.

эмне кылуу керек?Күйүү температурасын мүмкүн болушунча жогорулатыңыз.

Көптөгөн реагенттер өндүрүүчүлөр гендик инженерия аркылуу тескери транскриптазасын жакшыртышат.Кээ бирлери реакциянын температурасын жогорулатат, мисалы, Жифан жана Айделай, ал эми кээ бирлери фермент менен РНК шаблонунун ортосундагы жакындыкты жакшыртуу үчүн RNase H ферментинин активдүү тобун алып салышат.Жогорку жакындык атаандаштык менен экинчи структураны кысып, жылмакай окуй алат, ошондой эле тескери транскрипциянын натыйжалуулугун бир топ жакшыртат.
Негизги пункт: Тескери транскрипциянын ырааттуулугун (ферменттер эффективдүү гана болбостон, ошондой эле туруктуу болушу керек), жүктөлгөн үлгүнүн көлөмүнө эмес, ырааттуулугуна умтулуу үчүн тескери транскрипция маанилүү, эгерде ал өзгөчө масштабдуу флуоресценттик сандык ПТР болбосо, ал такыр мүмкүн болбойт.Бир нече cDNAs.
Ар кандай өндүрүүчүлөр да ырааттуулукка умтулуу үчүн кээ бир аракеттерди жасашкан.Мисалы, көпчүлүк компаниялар азыр тескери транскрипцияны сатуу үчүн стандарттуу комплект катары топтошту, бул жакшы тандоо.
Мисалы, Foregene's RT Easy Series комплекттери:

RT Easy I (биринчи катардагы cDNA синтези үчүн мастер премикс)

MIQE (5) – максаттуу ген маалыматы

Жогорудагы сүрөттө түшүндүрөт
1. Бул ген кайра-кайра эксперименттер үчүн натыйжалуу же жокпу, жалпысынан кайталанган эксперименттер менен текшерилиши мүмкүн.
2. Ген ID, билесизби.
3. Ген узундугу, максаттуу гендин жалпы узундугу, албетте, эч кандай көйгөй эмес.Праймерлерди долбоорлоодо, күчөтүү эффективдүүлүгүн камсыз кылуу үчүн ампликондун узундугу 80-200бп ортосунда болушун камсыз кылыңыз.
4. Sequence Blast салыштыруу маалыматы, максаттуу ген спецификалык эмес күчөтүүнүн алдын алуу үчүн ген банкында салыштырылышы керек.
5. Псевдогендердин болушу.Псевдоген – бул кадимки генге окшош, бирок өзүнүн нормалдуу функциясын жогото турган ДНК тизмеги.Ал көбүнчө эукариоттордун көп гендик үй-бүлөсүндө болот.Ал, адатта, ψ менен көрсөтүлөт.Бул коддоочу ген ырааттуулугуна абдан окшош геномдогу функционалдык эмес геномдук ДНКнын көчүрмөсү., көбүнчө транскрипцияланбайт жана так физиологиялык мааниси жок.
6. Праймерлердин экзондор менен интрондорго салыштырмалуу абалы.Алгачкы жылдарда, биз ДНКнын булгануусу проблемасын чечкенде, биз көбүнчө праймерлердин, экзондордун жана интрондордун позицияларына көңүл бурчубуз жана ДНКнын күчөшүнө жол бербөө үчүн жалпысынан интрондор боюнча праймерлерди долбоорлоону ойлончубуз.Сураныч, төмөндөгү сүрөттү караңыз: кара түс интрондорду, ар кандай блюз - экзондорду, кызгылт - жалпы праймерлерди, ачык кызыл - интронду камтыган праймерлерди билдирет.

Схематикалык, эч качан туура эмес
Бул кандай кемчиликсиз пландай көрүнөт, бирок чындыгында, көпчүлүк учурларда транс-интрондук праймерлер ойлогондой сыйкырдуу эмес жана алар спецификалык эмес күчөтүүгө да себеп болот.Демек, ДНКнын булганышын алдын алуунун эң жакшы жолу – ДНКны толугу менен алып салуу.
7. Конформацияны болжолдоо.Бул мисалды дагы бир жолу колдонуп, mFold онлайн куралын колдонуп, белгилүү бир температурада жана туз концентрациясында максаттуу фрагменттин экинчи структурасын аныктаңыз.

РНКнын ар кандай температурадагы экинчилик структурасы
Экинчи структура - бул шаблондун өзүн толуктоочу жупташтыруу, бул праймер менен шаблонду жупташтыруунун ортосунда күчтүү атаандаштыкка алып келет жана праймерди бириктирүү мүмкүнчүлүгү азыраак, натыйжада E төмөн жана начар кайталануучу сыяктуу бир катар көйгөйлөр пайда болот.Программалык камсыздоону болжолдоо аркылуу, эгерде экинчи даражадагы структура көйгөйү болбосо, бул эң сонун болмок.Эгер бар болсо, биздин кийинки макалада бул көйгөйдү кантип чечүү керектиги талкууланат.

MIQE (6) — qPCR олигонуклеотиддери

Флуоресценттик сандык ПТР үчүн сиз күн сайын күрөшүп жаткан биринчи нерсе - РНКны экстракциялоо, ал эми экинчиси - праймер дизайны болушу мүмкүн.
Биринчиден, биз дагы эле MIQE текшерүү тизмесине ылайык праймерди долбоорлоо эрежелерин текшеребиз.Ушунчалык жөнөкөй, шылуундар күлүшү мүмкүн жана биз аны бир сүйлөм менен бүтүрө алабыз: праймердик зонддун ырааттуулугун жана абалын жана өзгөртүү ыкмасын билип алыңыз.Праймерди тазалоо ыкмасы үчүн праймердин синтези азыркы учурда абдан арзан, qPCR PAGE жана андан жогору тазалоо ыкмаларына татыктуу жана синтез инструментинин маалыматы маанилүү эмес.Көптөгөн адамдар ондогон жылдар бою праймерлерди жасап келишет жана синтезатор ABI3900 экенин билишпейт.
Праймерди долбоорлоо принциптерине келсек, аларды жаттап алуунун кереги жок, анткени көпчүлүк праймерди долбоорлоочу программалык камсыздоо же онлайн инструменттери бул көйгөйлөрдү чече алат (сунушталган онлайн курал primer3.ut.ee/), ал эми праймер дизайнынын 99,999% кол менен жасалбайт Караңыз, автор кээде жүздөгөн праймерлерди бир күндө иштеп чыгат, эгер сиз бирден окусаңыз, аны кайчылаш болуп калат.
Праймерлер иштелип чыккандан кийин, төмөнкү пункттарды текшериңиз:
1. Дизайн праймерлери 3′ учуна жакын: cDNA биринчи катардагы синтези үчүн олиго dT праймерлерин колдонгон учурда, тескери транскрипциянын эффективдүүлүгүн жана РНКнын бүтүндүгүн эске алуу менен, иштелип чыккан праймерлер күчөтүү эффективдүүлүгүн жогорулатуу үчүн 3′ аягына жакын иштелип чыгышы керек.Төмөнкүдөй түшүндүрүү үчүн сүрөттү колдонуңуз (муну түшүнүүгө эч кандай жол жок):

Эмне үчүн праймерлер 3′ аягына жакын жасалышы керек, бул туура эмес болушу керек
2. ТМ мааниси: Tm мааниси 55-65°C (себеби экзонуклеаза активдүүлүгү эң жогорку 60°C), ал эми GC мазмуну 40%-60% түзөт.
3. BLAST: геномдун спецификалык эмес күчөшүнө жол бербөө үчүн, Blast кошумча текшерүү үчүн колдонулушу керек.

MIQE(7) — qPCR процесси

1. qPCR комплекти
MIQE талаптарына ылайык, макалада реакциянын толук шарттарын, анын ичинде ПТР реакция системасынын конфигурациясын, кандай комплект колдонулат, өндүрүүчү ким, реакция системасы канчалык чоң, боёк ыкмасы же зонд ыкмасы колдонулабы, ПТР программасынын жөндөөлөрү так сүрөттөлүшү керек.Ардагер айдоочулар комплекти тандалып алынгандан кийин, жогорудагы маалымат негизинен аныкталат.
Азыркы учурда флуоресценттик сандык ПТР комплекттерин өндүрүү жана өндүрүү абдан жетилген технология болуп саналат.Өтө начар өндүрүүчүлөрдү тандабасаңыз, көйгөйлөрдүн ыктымалдыгы жогору эмес, бирок биз дагы эле сиз менен бир нече ойлорду бөлүшкүбүз келет:
Hot-start Taq ферменти:ПЦРдин эң маанилүү бөлүгү - бул ысык башталгыч Taq ферменти.Базардагы ысык старт ферменттери жалпысынан эки түргө бөлүнөт, бири химиялык жактан өзгөртүлгөн ысык старт ферменти (сиз аны парафинди кыстаруу катары элестете аласыз), экинчиси - антителолорду модификациялоо үчүн ысык баштоо ферменти (антиген-антитело байланышы).Химиялык модификация - ферменттерди ысык баштоонун алгачкы жолу.Белгилүү бир температурага жеткенде фермент өзүнүн активдүүлүгүн коё берет.Антитело менен өзгөртүлгөн ысык баштоо ферменти ферменттин активдүүлүгүн бөгөттөө үчүн биологиялык ыкмаларды колдонот.Белгилүү бир температурага жеткенде антитело денатурат болуп, протеин катары инактивацияланып, ферменттин активдүүлүгү ишке киргизилет.

Бирок, мунун кандай пайдасы бар?Бул антитело менен модификацияланган ферменттердин чыгаруу активдүүлүгү химиялык жактан өзгөртүлгөн ферменттерге караганда тезирээк болот, ошондуктан сезгичтик жагынан антитело менен модификацияланган ферменттер бир аз артыкчылыкка ээ, андыктан рынокто комплекттерде химиялык жактан өзгөртүлгөн ферменттер негизинен жок.Эгер бар болсо, анда бул өндүрүүчүнүн технологиясы дагы эле миң жылдыктын доорунда тыгылып калган.
Магний ионунун концентрациясы:ПЦР реакциясында магний ионунун концентрациясы абдан маанилүү.Тиешелүү магний ионунун концентрациясы Taq энзиминин активдүүлүгүн чыгарууга көмөктөшөт.Эгерде концентрация өтө төмөн болсо, ферменттин активдүүлүгү кыйла төмөндөйт;концентрация өтө жогору болсо, ферменттин катализделген спецификалык эмес күчөшү күчөйт.Магний иондорунун концентрациясы ошондой эле праймерлердин күйдүрүүсүнө, шаблондун жана ПЦР продуктуларынын эрүү температурасына таасирин тийгизет, ошону менен күчөтүлгөн фрагменттердин түшүмдүүлүгүнө таасирин тийгизет.магний иондорунун концентрациясы жалпысынан 25mM көзөмөлдөнөт.Албетте, жакшы комплект үчүн магний иондорунун концентрациясы жакшы көзөмөлгө алынышы керек.Кээ бир соодагерлер реагентке магний ионунун хелаттоочу агентин кошушат, ал магний ионунун концентрациясын автоматтык түрдө жөнгө салуу эффектине жетише алат.
Fluorescent боёк концентрациясы:Көбүнчө биз колдонгон SYBR Green болгон флуоресценттик боёк, негизинен, кош тилкелүү ДНКнын кичинекей оюгу менен байланышып, флуоресценцияны жаратат, анткени боёктун эки спиралдуу ДНКга байланышы спецификалык эмес, б.а. кош тилкелүү ДНК аны менен айкалышканда, флуоресценция түзүлөт. фон сигналын түзөт.
PS: Жарыкка сезгич касиеттеринен улам, рыноктогу өнүмдөр көбүнчө күрөң тунук эмес центрифуга түтүктөрүнө таңгакталган (төмөндөгү сүрөттө көрсөтүлгөндөй).Бирок, бул көйгөйгө дуушар болот.Үлгү алууда суюктуктун сорулуп же соруп жатканын көрүү кыйын.Бул жагынан алганда, Qingke чындыгында колдонуучуга эң ыңгайлуу (төмөндөгү сүрөттө көрсөтүлгөндөй) жана тунук түтүк тунук эмес калай баштыкка салынган.Андан кийин жарыктан качуу жана үлгү алуу ыңгайлуулугун эске алып, аны калай баштыкка салыңыз.Сиз туура продукт номерин тандоо керек.TSE204 - бул абдан үнөмдүү нерсе, бул мени чөп отургузууну каалайт.

Флуоресценттик боёктун концентрациясы да абдан маанилүү.Эгерде концентрация өтө төмөн болсо, анда күчөтүү ийри сызыгы кийинки этапта көтөрүлбөйт жана идеалдуу эмес;концентрациясы өтө жогору болсо, ызы-чуу кийлигишүүсүн алып келет.Флуоресценттик сандык ПТР негизинен КТ маанисинен көз каранды болгондуктан, флуоресценттик боёктун концентрациясы туура жөнгө салынбаса, төмөнкү чекит жогорку чекитке караганда жакшыраак.Албетте, тиешелүү боёк концентрациясы эң жакшы.

ROX: ROX боёктору жакшы флуоресценттик сигнал каталарын оңдоо үчүн колдонулат.Кээ бир инструмент өндүрүүчүлөр калибрлөө талап кылат, ал эми башкалары жок.Мисалы, Thermo Fisher Scientific's Real Time PCR күчөтүү инструментин колдонуу адатта калибрлөө талап кылат, анын ичинде 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus ж.б. Жалпы комплект нускамалары аны сүрөттөйт.
Foregene's qPCR Mix ошондой эле ар кандай моделдерде колдонууга ыңгайлуу ROX боёгу камтыйт.

Real Time PCR Kit-Taqman

Алсыз суутек байланышын дарылоо: Алсыз суутек байланыштарын дарылоо салыштырмалуу техникалык маселе.Көптөгөн комплекттердин колдонмолорун эч нерсе окуган эмес, бирок алардын бири да бул теманы айткан эмес.Чынында, бул абдан маанилүү.Негиздердин айкалышы негизинен суутек байланыштарынын бекемдигинен көз каранды.Күчтүү суутек байланыштары кадимки күчөтүү болуп саналат, ал эми алсыз суутек байланыштары спецификалык эмес күчөтүүгө алып келет.Эгерде алсыз суутек байланыштарын жок кылуу мүмкүн болбосо, анда спецификалык эмес күчөтүүдөн качууга болбойт.Автордун чөйрөсүндө бул көйгөйдү бир нече гана компаниялар байкашкан.Сиз комплектти сатып алууда, сиз тандагыңыз келген комплект боюнча бул жагынан чечимди карап көрдүңүзбү дегенге кайрыла аласыз.

Реакция көлөмү: 20-50ul системасы көбүрөөк колдонулат, ал эми кичине көлөмү каталарды алып келиши мүмкүн.Жалпысынан алганда, комплекттин көрсөтмөлөрү ПТР реакциясынын көлөмүн колдонууну сунуштайт.Акылдуу болбоңуз жана чыгымдарды үнөмдөө үчүн азыраак көлөмдөрдү колдонуңуз.максаты.Соодагерлер тарабынан сунушталган көлөм чындыгында сыналган жана алар аз көлөмдөн улам келип чыккан каталар маселесин чече албай калышы мүмкүн.
2. Түтүк табличканын чыгаруучу жана макала номери
Ар бир адам флуоресценттик сандык ПТР принцибин билет.Fluorescence чогултуу негизинен ПТР түтүк капкактары аркылуу жүзөгө ашырылат.ПЦР сарпталуучу материалдарды тандоодо эки жагдайга көңүл буруңуз: жарыктын жакшы өтүшү жана аспапка ылайыктуу.Жалпысынан алганда, негизги бренддердин такталары жана түтүктөрү жакшы, бирок адаптациялоо жагынан кылдаттык менен тандоо керек, антпесе аспапты колдоно албай каласыз.

4. Жогорку деңгээлдеги билим

MIQE (8) — qPCR валидациясы
Бул qPCRдин эң башкы приоритети!Бул жерде канчалаган баатырлар кумга түшүп кеткен.Арийне, балким, сенин да жолуң бар, изилдеген гендериң жөнөкөй болгондуктан, шамалды бойлой муз үңкүрүн аралап сүздүң.qPCR текшерүү маалыматы маалыматтардын ишенимдүүлүгүн текшерүү үчүн арналган.Биз керектүү текшерүү маалыматтарын төмөндөгүдөй тизмелейбиз:

1. Өзгөчөлүк тести
Максаттуу гендин күчөшүнүн өзгөчөлүгү электрофорез сүрөтүнүн бир тилке экендигин текшерүү аркылуу текшерилет;ырааттуулугун текшерүү;чокусу карта жалгыз экенин көрүү үчүн эрүү ийри;ферменттерди сиңирүүнү текшерүү жана башка ыкмалар.
Бул жерде биз тал ийри сызыктарды эрүү ыкмасы менен спецификалык эмес күчөтүүнү талдоо.Жалпысынан алганда, биз праймерлерди иштеп чыкканда, продукт фрагментинин өлчөмү 80-200bp диапазонунда болушу талап кылынат, бул ПТР продуктунун эрүү температурасын 80-85 °C диапазонунда түзөт.Ошондуктан, ар кандай чокулары бар болсо, анда башка атайын эмес күчөтүү продуктулары болушу керек;чокусу 80 ° C төмөн пайда болсо, анда ал жалпысынан праймер димер болуп эсептелет;эгерде чокусу 85°Cден жогору болсо, бул көбүнчө ДНКнын булганышы же чоң фрагменттердин өзгөчө эмес күчөшү деп эсептелет.
Эскертүү: Кээде 80°C бир гана чокусу болот.Бул учурда бул концепцияны кармануу керек.Бул күчөтүү натыйжалары бардык праймер димерлер болушу мүмкүн.

Кадимки эрүү ийри (спецификалык эмес күчөтүү менен бир чокусу)

Проблемалуу эрүү ийри сызыгы (жалган чокулардын спецификалык эмес күчөшү)
【Иштин анализи】

Негизги чокусу бар, бирок праймер димери олуттуу
Төмөндөгү сүрөттө бир чокулуу эрүү ийри сызыгы бул идеалдуу эксперимент деп ойлоп, көзүңүздү оңой эле алдашы мүмкүн, бирок натыйжа такыр туура эмес.Бул учурда, биз эрүү температурасын карашыбыз керек.Чокусу температурасы 80 ° C төмөн, бул толугу менен праймер-димер.

Максаттуу фрагмент жок, бардык праймер димерлери
Мына, иним токтоно албайт.Төмөндөгү сүрөттө бир шылуун жиберген уюлдук телефон менен тартылган сүрөт.Ал колдонгон реагенттер – бул өнөр жайда кеңири колдонулган бренддер.Ал бир T-префикс брендинен башка Т-префикс брендине өзгөрдү.Менимче, сиз буга чейин эле болжолдуңуз.Акылсыз мага ыйлады: «Биринчи сүрөттө колдонулган реагент өтө жакшы, чокусу жалгыз.Кийинчерээк, сиз сунуш кылган реагентти колдонгондон кийин, ал аралаш чокулары менен экинчи сүрөттөгүдөй болуп калат.Сен мени бактысыз кылып койдуң."
Эки графикти ажыратыңыз.Бир караганда, биринде бир чоку, экинчисинде кош чоку бар.Болуптур, бир чокусу албетте жакшы.Бул чынбы?
Доу Эден да жаманы, эки сүрөттү төмөндөгү сүрөттө койсом, дароо түшүнөсүң.Чынында, биз мындай сүрөттөн оңой эле шал болуп калабыз.кылдат талдоо кийин, биз табылган: биринчи көрсөткүчтүн чокусу 75 ° C, толугу менен праймер dimer болуп саналат;экинчи көрсөткүчтүн чокусу 75 ° C жана 82 ° C пайда болот, жок эле дегенде, бар Продукт пайда болот.

Студенттердин пикири боюнча сүрөттөр
Демек, негизги маселе реагенттер маселеси эмес, праймерди долбоорлоо маселеси.Ошол эле учурда, кээ бир чоң бренддердин темир сапаты жок экенин далилдейт жана менин агамдын айтканын дагы далилдейт: Сиздин макалаңызды колдогон реагент бренди эмес.Бул сиздин макалаңыз реагенттердин брендин көтөрдү.Элестетип көргүлөчү, эгерде шылуун реагенттерди алмаштырбаса, журналга туура эмес маалыматтар түшүп, эмнелер трагедия болмок.
2. Бланкалык башкаруунун Ct ​​мааниси
Түшүндүрбөңүз, эгерде бош контролдун Ct ​​мааниси болсо, бул булгануу эмеспи?Бирок, сиз дагы эле кайсы бош башкарууда Ct мааниси бар экенин түшүнүшүңүз керек.Бул NTC болсо, бул реагенттин булганышы сыяктуу чет элдик ДНК бар экенин билдирет.Эгерде ал NRT болсо, анда алынган РНКда ДНКнын булганышы бар дегенди билдирет.
3. Стандарттык ийри сызык
Эңкейүү жана эсептөө формуласын кошкондо, ПТР эффективдүүлүгүн формула аркылуу эсептөөгө болот.Кемчиликсиз эксперимент үчүн стандарт ийри сызыгынын эңкейиши 3,32ге, ал эми R² 0,9999га жакын болушу керек.
4. Сызыктуу динамикалык диапазон
Реакциянын динамикалык диапазону сызыктуу.Стандарттык ийри сызыкты түзүү үчүн колдонулган шаблонго ылайык, динамикалык диапазон кеминде 5 концентрация градиентин камтышы керек жана жогорку концентрация градиенттеринде жана аз концентрация градиенттеринде Ct маанилеринин өзгөрүшүнө көңүл буруу керек.
5. аныктоонун тактыгы
qPCR натыйжаларынын өзгөрүшү, башкача айтканда, начар кайталануучу, башкача айтканда, начар тактык температура, концентрация жана иштөө сыяктуу көптөгөн факторлордон улам келип чыгат.Көчүрмөлөрдүн саны азайган сайын qPCR тактыгы көбүнчө азыраак көзөмөлдөнүп калат.Идеалында эксперименталдык вариация, бул техникалык вариация биологиялык вариациядан айырмаланып турушу керек жана биологиялык репликациялар топтордун же дарылоонун ортосундагы qPCR натыйжаларындагы статистикалык айырмачылыктарды түз чече алат.Атап айтканда, диагностикалык анализдер үчүн сайттар жана операторлор боюнча эң мыкты анализдер аралык тактык (кайталануучулук) билдирилиши керек.
6. Детекциянын эффективдүүлүгү жана LOD (мультплекстүү qPCRде)
LOD аныкталган оң үлгүлөрдүн 95% эң төмөнкү концентрациясы.Башка сөз менен айтканда, максаттуу ген репликаттарынын топтому ичинде камтылган LOD концентрациясы ийгиликсиз реакциялардын 5% ашпоого тийиш.Мультиплекстүү qPCR анализин жасап жатканда, өзгөчө чекиттик мутацияларды же полиморфизмдерди бир эле учурда аныктоо үчүн, мультиплекс qPCR бир түтүктө бир нече максаттуу фрагменттердин тактыгы бузулбаганын далилдеп бериши керек, бир нече жолу аныктоо жана бир түтүктү аныктоонун эффективдүүлүгү жана LOD бирдей болушу керек.Айрыкча, жогорку концентрациядагы максаттуу гендер менен аз концентрациядагы максаттуу гендер бир эле учурда күчөгөндө, бул көйгөйгө көңүл буруу керек.
Проблемалар жана чечимдерЖалпысынан алганда, qPCR мүчүлүштүктөрдү оңдоодо көп кездешкен көйгөйлөр төмөнкү аспектилерге багытталган:
·спецификалык эмес күчөтүү
· Праймердин концентрациясын тандоо кыйын жана праймер-димерлер менен кыйынчылыктар
· Жылуулоо температурасы туура эмес
·Экинчи структурасы күчөтүү эффективдүүлүгүнө таасир этет
спецификалык эмес күчөтүү
спецификалык эмес күчөтүүпайда болгондо, негизинен, праймердин дизайны ылайыктуу эмес деп эсептелинет, бирок сиз праймерлерди өзгөртүүгө шашпасаңыз, адегенде төмөнкү ыкмаларды колдонуп көрүңүз (принцип дагы тиркелет):
· Күйүү температурасын жогорулатуу – алсыз суутек байланыштарын кармап турууга аракет кылыңыз;
·Кыскартуу жана узартуу убактысы – алсыз суутек байланыштарынын мүмкүнчүлүгүн азайтат;
·Праймердин концентрациясын азайтуу – ашыкча праймерлерди жана максаттуу эмес аймактарды бириктирүү мүмкүнчүлүгүн азайтуу;
Төмөн күчөтүү натыйжалуулугу
Спецификалык эмес күчөтүүгө карама-каршы жагдай – төмөн күчөтүү эффективдүүлүгү жана төмөн күчөтүү эффективдүүлүгү менен күрөшүү чаралары тескерисинче:
· Күйүү жана узартуу убактысын узартуу;
· Үч баскычтуу ПТРге өтүү жана күйүү температурасын төмөндөтүү;
·Праймердин концентрациясын жогорулатуу;
Ps: 90-жылдары туулган көптөгөн аспиранттар эксперименттерди кантип оңдоону үйрөнүүнү каалашпайт жана комплект көйгөйдү толугу менен чече алат деп үмүттөнүшөт (эгерде сиз окууну аяктагандан кийин реагент компаниясына барып изилдөө жана иштеп чыгууну кааласаңыз), чындыгында, реагент өндүрүүчүлөр да ушундай деп ойлошот, мен бул акылсыздык деп үмүттөнөм. начар Н-байланыш сиңирүү факторлорунун киргизилиши.Көйгөйдү оңой чечүү үчүн, акылсыздар алсыз суутек байланыштарын сиңирип алуучу фактор бар же жок экенин билиш үчүн дагы эле реагент компаниясынын киришүүсүн окуп чыгышы керек.
Праймердин концентрациясын тандоо кыйын жана праймер-димерлер менен кыйынчылыктар
Метод 1: Жалпысынан алганда, qPCR үчүн комплект нускамаларында сунушталган системалар жана сунушталган праймер концентрациялары бар.
Метод 2: Праймер концентрациясынын градиентин орнотуу менен мүчүлүштүктөрдү оңдоо.Төмөндөгү сүрөт компаниядан уурдалган.Төмөнкү сүрөттө үч праймер концентрациясынын градиенти (100nM, 250nM, 500nM) жана төрт калыптын концентрация градиенттери (0.1ng, 1ng, 10ng, 100ng) менен жасалган флуоресценциянын сандык натыйжалары көрсөтүлгөн.Эксперименттик натыйжалардын Ct мааниси төмөнкүчө чагылдырылган:

Праймердин концентрациясын тандоо Ар бир праймер концентрациясын төмөнкүдөй сапка бириктириңиз:

Пример концентрациясын тандоо ачык-айкын, 100nM жана 250nM праймер концентрациясынын сызыктуу байланышы жакшыраак, ал эми 500nM праймер концентрациясынын сызыктуу байланышы салыштырмалуу начар.100nM жана 250nM, 250nM Ct мааниси салыштырмалуу аз, ошондуктан оптималдуу праймер концентрациясы 250nM болуп саналат.Жалпысынан катуу праймер-димерлер эрүү ийри көрүүгө болот.Эгерде иштелип чыккан праймерлер праймер-димерлерден кача албасачы?
Метод 3: Праймерлердин санын азайтыңыз жана күйгүзүү температурасын жогорулатыңыз (түшүндүрүүнүн кереги жок).
Күйүү температурасынын эмпирикалык мааниси 60°С.Эгерде сиз ишенбесеңиз, канткенде ылайыктуу температураны тандоо керек?Жооп праймер концентрациясын тандоо менен бирдей -градиент тести.Көйгөйдү көрсөтүү үчүн Bio-rad компаниясынын сүрөтүн тартыңыз.Белгилүү бир максаттуу фрагментти күчөтүү үчүн ар бири үч жолу кайталануучу сегиз температура градиентин орнотуңуз жана алынган күчөтүү ийри сызыгы төмөнкүдөй:

күйгүзүү температурасын тандоо:
·70°C, 69°C—Негизинен, праймерлерди бириктирүү мүмкүн эмес, андыктан күчөтүү болбойт.
·67,3°C – Башында бир аз күчөтүү бар, ал эми Ct мааниси салыштырмалуу чоң.
·64,5°C——Ct мааниси төмөндөйт.
· 60,7°C, 58,0°C, 56,2°C жана 55,0°C температурада Ct маанилери негизинен туруктуу болгон, бирок акыркы флуоресценция маанилери башкача болгон.
Кантип тандоо керек?Принцип: Биринчи принцип жогорку Ct мааниси.Ошол эле Ct мааниси үчүн димеризацияны жана спецификалык эмес күчөтүүнү болтурбоо үчүн жогорку температураны тандаңыз.55 ° C жогорку fluorescence мааниси бар болсо да, анда dimers же спецификалык эмес күчөтүү болушу мүмкүн.
Бирок, эгер сиз сыяктуу акылдуу болсоңуз, анда сөзсүз түрдө ойлоносуз: Логикалык жактан айтканда, ПЦР реакциясы өтө спецификалык болсо, праймердин концентрациясы минималдуу талаптан ашып кетсе, флуоресценттик боёктор жана dNTPs сыяктуу жогорку жана төмөнкү чекиттер эч кандай таасир этпеши керек.Чынында эле, күйдүрүү температурасы туура оптималдаштырылса, праймер концентрациясынын Ct маанисине тийгизген таасири табигый түрдө минималдуу болот.

Күйүү температурасы туура оптималдаштырылган жана КТ боюнча праймер концентрациясынын таасири минималдуу болот
Экинчи структурасы күчөтүү натыйжалуулугун таасир этет
Маселени түшүндүрүү үчүн Био-раддан сүрөттү алып көрөлү.Ал ошондой эле экинчи структурасы бар генди күчөтүү үчүн температура градиентин иштеп чыгат.

Экинчи структура пайда болот
Температура градиентинин төмөндөшү менен продуктылар пайда боло баштаганын жана Ct мааниси алдыга жылып, 60,7°С минималдуу мааниге жеткенин, андан кийин температура градиентинин төмөндөшү менен Ct мааниси чоңойорун көрүүгө болот.Тескерисинче, температура жогорулаган сайын экинчи структура ачылып, күчөтүү эффективдүүлүгү жогорулайт.белгилүү бир температурага жеткенден кийин, температураны жогорулатуу күчөтүү натыйжалуулугун жогорулатуу мүмкүн эмес.Анткени бул учурда праймерлерди туруктуу айкалыштыруу мүмкүн эмес.Ошондуктан,эң төмөнкү Ct мааниси менен температураны издеңиз, бул экинчи структуранын шаблонун күчөтүү үчүн эң жакшы температура!Албетте, акылдуу келесоолор билиши керек, эгерде зарыл болбосо, праймерлерди алмаштырып, орто түзүм аймагынан качуу жакшы.
5. Колдонмо деңгээли
MIQE — Маалыматтарды талдоо

Маалыматтарды талдоо негизинен флуоресценттик сандык ПТР аспабы менен берилет.Мурунку макалада, эксперименттин дизайнында түшүндүрүлгөн бош башкаруу сыяктуу көптөгөн маалыматтарды талдоо иштери аткарылган.Ички референт гендер, кайталануучу сандар жана башкалар такталган., бул жерде биз негизинен qPCR колдонууну түшүндүрөбүз.
qPCR кеңири колдонулат жана эксперименталдык текшерүү жана нуклеиндик кислота диагностикасы эң көп колдонулган сценарийлер болуп саналат.
абсолюттук сандык көрсөткүч
Журнал (баштапкы концентрация) циклдердин саны менен сызыктуу байланышка ээ.Алгачкы көчүрмө номери белгилүү болгон стандарттан стандарттуу ийри сызыкты түзүүгө болот, башкача айтканда, күчөтүү реакциясынын сызыктуу байланышын алууга болот.Үлгүнүн Ct маанисине ылайык, үлгүдөгү концентрацияны эсептөөгө болот.Кошула турган калыптардын саны.

Абсолюттук сандык эсептөө ыкмасы
Абсолюттук сандык аныктоо стандарттык ийри сызыктын негизинде болушу керек.Стандарттык ийри сызыкты жасоо үчүн стандарт талап кылынат.Адатта, стандарт максаттуу генди клондоо жолу менен алынган плазмид болуп саналат.Эмне үчүн бул плазмид?Анткени тегерек плазмида ДНКсы эң туруктуу.Стандарттык продуктуну 5-6 градиентте эки эселенген коэффициентке ылайык суюлтуңуз (10 эсе суюлтуу) жана суюлтууда бир тектүүлүккө көңүл буруңуз.Ct мааниси 15-30га чейин түшсүн.

Стандарттык даярдоо
Ошол эле учурда, текшериле турган үлгү да ошого жараша суюлтулуп (суюлтуу коэффициентин эстен чыгарбоо керек) жана Ct мааниси да 15-30га чейин түшүшү керек.Стандарттык продукт + сыналуучу үлгү чогуу машинага коюлат.Чуркоодон кийин стандарттуу зат менен стандарттуу ийри сызык түзүлүп, концентрацияны эсептөө үчүн текшериле турган үлгүлөр стандарттык ийри сызыкка киргизилди.
Гепатит В вирусунун HBV сандык көрсөткүчү типтүү абсолюттук сандык көрсөткүч болуп саналат, ал 1 мл кандагы вирустун көчүрмөсүн эсептей алат.
Көчүрмө санын эсептөө
Сыналуучу үлгү концентрациясы (ng/ul) = OD260 × 50ug/ml × суюлтуу коэффициенти
Үлгү молекулярдык салмагы = негиздер саны × 324
Сыналуучу үлгүнүн көчүрмөсү (көчүрмөлөр/ул) = сыналуучу үлгүнүн концентрациясы / үлгүнүн молекулярдык салмагы × 6 × 1014

Көчүрмө санын эсептөө ыкмасы

Жогорудагы санды аныктоо үчүн эсептөө ыкмасы болуп саналат.Бул толук эмес орто мектепти аяктагандан кийин чечиле турган математикалык маселе жана математикалык маселелерди көбүнчө компьютерлер чечет.Түшүнбөсөңүз, баарлашууга келсе болот.
салыштырмалуу сандык аныктоо
Салыштырмалуу сандык көрсөткүч негизинен илимий изилдөөдө колдонулат.1мл канда канча вирус бар жана бул ДНК вирусу, бул салыштырмалуу детерминисттик окуя: кандын көлөмүн аныктоого болот, ал эми ДНК вирусу салыштырмалуу туруктуу.Бирок жалбырактагы белгилүү бир гендин транскрипция көчүрмөлөрүнүн санын салыштыруу биз үчүн кыйын, анткени жалбырактын көлөмүн, салмагын жана назиктигин аныктоо кыйынга турат, алынган РНКнын көлөмүн аныктоо кыйынга турат жана тескери транскрипциянын эффективдүүлүгүн аныктоо да кыйынга турат, башкача айтканда, кандайдыр бир кадам эксперименталдык маалыматтарда мүчүлүштүктөрдү жаратышы мүмкүн жана аны колдонуу мүмкүн эмес.
Демек, салыштырмалуу сандык аныктоо бир элементти киргизүү керек:ички шилтеме ген.
Башка сөз менен айтканда, салыштырмалуу сандык аныктоо иш жүзүндө максаттуу ген менен ички шилтеме гендин ортосундагы салыштыруу болуп саналат.Ошол эле кыртышта жана ошол эле клеткада салыштырганда, үлгү өлчөмү, РНК алуу көлөмү, тескери транскрипция натыйжалуулугу жана ПЦР натыйжалуулугу салыштырмалуу аз.Үлгү көлөмү кичинекей болгондуктан, ички маалымдама гендер да, максаттуу гендер да салыштырмалуу кыскарган.Мына ушундан улам биз буга чейин бирдиктүүлүккө жана туруктуулукка басым жасап келгенбиз.
Ички шилтеме гендер көбүнчөчарбалык гендер(үй сактоочу гендер), бардык клеткаларда туруктуу экспрессияланган гендердин классына тиешелүү жана алардын продуктулары клеткалардын негизги жашоо активдүүлүгүн камсыз кылуу үчүн зарыл.
Бул түшүнүктү чаташтырбаңыз.Үй чарба гендери биологиялык функция терминдери, ал эми ички маалымдама гендер эксперименталдык техникалык терминдер.Үй чарба гендери ички маалымдама гендер катары тандалганга чейин валидациядан өтүшү керек.
Мисалы, биз ар кандай кыртыш клеткаларында алардын экспрессия деңгээлин текшерүү үчүн төмөндөгү сүрөттө бир нече үй чарба гендерин тандап алдык жана β-2-микроглобулиндин экспрессия деңгээли башка үч гендикинен такыр башкача экенин аныктадык, ошондуктан аларды ички шилтеме гендер катары колдонууга болбойт.

Ички референт генинин коррекциялоо функциясын түшүнгөндөн кийин, ички шилтеме генин киргизүүнүн эсебинен эки алгоритм чыгарылат.
·кош стандарттуу ийри сызык ыкмасы
·2 – △△Ct ыкмасы (КТ маанисин салыштыруу ыкмасы)
Эгерде сиз түрлөрдү жана ген функцияларын изилдөөгө кызыксаңыз, алгоритмдерди изилдөөдөн баш тартып, формулаларды түз колдонуңуз же түз эле машиналарды колдонуңуз;эгер сиз математика жана инженерия тармагында түз жигит болсоңуз, анда эркин сезиңиз.
кош стандарттуу ийри ыкмасы
Стандарттык ийри сызык аркылуу текшерилүүчү үлгүнүн максаттуу генин жана үй чарбалык генин сандык жактан аныктаңыз, андан кийин салыштырмалуу экспрессия деңгээли болгон эсептөө формуласына ылайык салыштырмалуу маанини эсептеңиз.
Артыкчылыктары: жөнөкөй талдоо, салыштырмалуу жөнөкөй эксперименттик оптималдаштыруу
Кемчилиги: Ар бир ген үчүн эксперименттердин ар бир айлампасы стандарттуу ийри сызык түзүшү керек
Колдонмо: ген экспрессиясын жөнгө салуу изилдөөдө эки көп колдонулган жана таанылган салыштырмалуу сандык ыкмалардын бири
Формула төмөнкүдөй:

Мисалдар төмөндөгүдөй:

Сандык натыйжанын негизинде салыштырмалуу сумманы эсептеңиз
2 – △△Ct ыкмасы (КТ маанисин салыштыруу ыкмасы)

Артыкчылыктары: Стандарттык ийри сызыкты жасоонун кереги жок
Кемчиликтери: күчөтүү эффективдүүлүгү 100% жакын деп болжолдонууда;стандарттык четтөө < 5% жана стандарттык ийри сызык жана ар бир күчөтүүнүн ортосундагы эффективдүүлүк ырааттуу деп кабыл алынат;эксперименттик шарттарды оптималдаштыруу кыйла татаал.
Колдонмо: ген экспрессиясын жөнгө салуу изилдөөдө эки көп колдонулган жана таанылган салыштырмалуу сандык ыкмалардын бири

Албетте, күчөтүү эффективдүүлүгү, адатта, кемчиликсиз 1 болушу мүмкүн эмес. Коррекциялоо ыкмасы: Эгерде биз максаттуу ген менен эталондук гендин күчөтүү эффективдүүлүгү бирдей экенин билсек, бирок күчөтүү эффективдүүлүгү 1ге барабар эмес болсо, анда 2－△△Ct төмөнкүдөй оңдоого болот: (1+E )－△△Ct, мисалы, ampl0c формуласы туура түзүлсө, эффективдүүлүктү 0c түзсө болот. чейин 1.95－△△Ct
Азырынча флуоресценттик сандык ПТРдин мазмуну аяктады.